马秋　章勇　王照国　段炼　宋俊蓉　刘务玲　王春林　杨华　李��

摘要 從植物精油中寻找新型抑菌剂是植物化学研究的一个方向。本试验提取了丁香、八角、孜然、薄荷和生姜5种药食兼用植物的精油，采用抑制菌丝生长法和96孔板法测试了5种精油对8种植物病原真菌和5种细菌的抑菌活性。结果表明5种植物精油对测试真菌有不同程度的抑制作用，丁香的抑制作用最强，对梨黑星病菌的抑制作用最强，其IC50为93.44 mg/L;5种植物精油对测试细菌的抑菌作用较弱，孜然和生姜精油对青枯菌的抑制最强，最小抑菌浓度（MIC）也仅为125 mg/L。采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析了各精油的主要化学成分，八角主要成分为茴香脑（53.16%），薄荷主要成分为长叶薄荷酮（15.85%），丁香主要成分为丁子香酚（82.68%），生姜主要成分为香叶醛（16.80%），孜然主要成分为茴香甲醛（46.06%）。本研究结果表明丁香具有开发为新型植物源抑菌剂的潜力。

关键词 植物精油; 抑菌活性; 化学成分

中图分类号： S 482.292

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019215

Antimicrobial activity of the essential oils from five plants

MA Qiu1，2， ZHANG Yong3， WANG Zhaoguo1，2， DUAN Lian1，2， SONG Junrong1，2，

LIU Wuling1，2， WANG Chunlin1，2， YANG Hua4， LI Yan1，2*

（1. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University

Guiyang 550014， China; 2. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and

Chinese Academy of Sciences， Guizhou Provincial Engineering Research Center for Natural Drugs，

Guiyang 550014， China; 3. Guangdong Engineering Research Center for Insect Behavior Regulation，

College of Agronomy， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

4. School of Chemistry and Chemical Engineering， Yanan University， Yanan 716000， China）

Abstract

Finding new bacteriostatic agents from plant essential oils is a trend in phytochemical research. In this study， the essential oils were extracted from five kinds of plants， Syzygium aromaticum， Illicium verum Hook. f.， Cuminum cyminum L.， Mentha haplocalyx Briq. and Zingiber officinale Roscoe by steam distillation. Antifungal and antibacterial activities of the essential oils from the five plants were tested by inhibiting mycelial growth and using 96-well method. The results of antifungal activity showed that the essential oils from the five plants had varying degrees inhibitory effects on the growth of eight plant pathogenic fungal hyphae. The antifungal activity of S.aromaticum oil was the strongest， with a 50% inhibition concentration （IC50） of 93.44 mg/L against V.piritna. The results of antibacterial activity showed that the essential oils had weak activities against all five tested bacteria. The oils of Z.officinale and C. cyminum showed strong activities against R.solanacearum and the minimum inhibitory concentration （MIC） was 125 mg/L. The chemical constituents of the essential oils were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The results showed that the main component of essential oils of I.verum was anethole （53.16%）. The main content of M.haplocalyx was pulegone （15.85%）， and the main contents of S.aromaticum， Z.officinale and C. cyminum were eugenol （82.68%）， geranyl aldehyde （16.80%）and fennel formaldehyde （46.06%）， respectively. These results indicated that S.aromaticum has the potential for development of novel plant-derived bacteriostats.

Key words

essential oil; antibacterial activity; chemical constituent

目前通常使用化学农药来防控植物病害，然而，随着化学农药的使用，其负面效应也逐渐显露出来，如病原微生物产生抗药性，对环境及其人体健康产生不利影响等，这些因素严重制约着化学农药的使用。随着人们生活水平的提高，越来越注重健康和食品安全，对食品的需求也越来越向“绿色”和“天然”转变，因此，开发天然、高效、低毒的抑菌产品已经成为研究的热点之一[1]。找寻“新型绿色抑菌剂”的需求显得尤为突出，从植物精油中寻找具有应用价值的抑菌剂是植物化学研究的一个方向。

植物精油（essential oil）是一类存在于植物体内、分子量较小的次生代谢产物，在常温下易挥发，具有一定气味的油状液体的总称[2]。因其来源于植物， 并具有多种生物活性，正日益受到科研工作者的关注[3]。近年来，研究报道了多种植物精油具有广谱的抗菌活性，对细菌、真菌均有显著的抑制作用[4-6]。

八角Illicium verum Hook.f.、丁香Syzygium aromaticum （L.） Merr. & L. M. Perry、孜然Cuminum cyminum L.、生姜Zingiber officinale Roscoe和薄荷Mentha haplocalyx Briq.均为药食兼用的植物，资源丰富，广泛应用于医疗保健和日常饮食中[7]。据报道，孜然精油的主要化学成分为2-蒈烯-10-醛[8-9]，抑菌活性测试表明其对晚疫病菌Phytophthora infestans、扩展青霉Penicillium expansum、匍枝根霉Rhizopus stolonifer、茄腐镰刀菌Fusarium solani均具有明显的抑制作用，最小抑菌浓度（MIC）依次为0.4‰、0.6‰、0.3‰、0.3‰[10]，对大肠杆菌Escherichia coli和福氏志贺氏菌Shigella flexneri作用最为明显（MIC均为25 μg/mL，MBC（最小杀菌浓度）均为50 μg/mL）[11]。丁香精油的主要化学成分为丁香酚和石竹烯[12]，其对食品中常见腐败菌及致病菌具有较强的抑制作用[13-15]。薄荷精油的主要成分为薄荷酮、异佛尔酮等[16]，对多种革兰氏阴性和阳性菌具有较好的抑制作用，MIC值范围为2.50%～0.62%[17]。八角精油主要成分为茴香脑、草蒿脑、茴香醚等，可显著抑制大肠杆菌E.coli、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、黑曲霉Aspergillus niger和黄曲霉A.flavus、棉花枯萎病菌F.oxysporum f.sp. vasinfectum （Atk.） Snyder & Hansen，MIC值为 0.5～80 mL/L[18-19]。生姜精油的主要化学成分为α-姜烯、β-倍半水芹烯[20-21]，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌Salmonella的MIC值均为0.1 g/mL，对志贺氏痢疾杆菌S.castellani和苏云金杆菌B.thuringiensis的MIC值均为0.05 g/mL[22]，对青霉Penicillium 和黑曲霉的MIC值均为0.78%[23]。

5种精油化学成分及抑菌活性虽有报道，但对于产地为贵州的5种植物精油的主要化学成分及抑菌活性鲜有报道，另外，5种精油针对农业致病菌的活性报道较少。鉴于此，本文采用水蒸气蒸馏法提取了產自贵州的5种植物的精油，并系统测试了5种精油对多种植物病原真菌、细菌及其他致病菌的抑制作用。以期能筛选出可有效防控植物病原微生物和其他致病菌的天然产物，为下一步开发为植物源杀菌剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物样品

八角I.verum和孜然C.cyminum的籽，丁香S.aromaticum的花蕾，生姜Z.officinale的块根，薄荷M.haplocalyx叶，5种植物样品均采自贵阳周边地区。

1.1.2 供试菌株

细菌：绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌S.aureus、大肠杆菌E.coli、青枯菌Ralstonia solanacearum和枯草芽胞杆菌B.subtilis，均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供。

真菌：黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、人参锈病菌Cylindrocarpon destructans、油菜菌核病菌S.sclerotiorum（Lib.）de. Bary、腐皮镰刀菌F.solani、立枯丝核菌R.solani、梨黑星病菌Venturia piritna Aderh、苍术黑斑病菌Alternaria tenuissima和根腐病菌P.cinnamomi，均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供。

1.1.3 培养基

Luria-Bertani液体培养基（LB）：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，加入去离子水至1 000 mL，用5 mol/L NaOH调pH至7.4，灭菌后备用。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基（上海博微生物科技有限公司）：马铃薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，氯霉素0.1 g，加蒸馏水1 000 mL，加热煮沸溶解，灭菌后备用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

RE 52-99型亚荣旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;ZNHW 型电热套（杭州明远仪器有限公司）;DL SB-5/20型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）;HBM-106型粉碎机（瑞安市瀚博机电有限公司）;FA2204B万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）;HZQ-F160A恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）;HP6890/5975C GC/MS 联用仪（美国安捷伦公司）。

1.2.2 试剂

无水乙醇、二氯甲烷、无水硫酸钠、二甲基亚砜（DMSO）均为市售分析纯，吐温-80为市售化学纯，纯水为本实验室制备。

1.3 试验方法

1.3.1 精油的提取

采用水蒸气蒸馏法提取5种植物精油[24]。将原材料阴干粉碎后过20目筛，各称取1 500 g新鲜样品置于5 000 mL的烧瓶中，按固液比1∶2加入3 000 mL蒸馏水，加热，保持沸腾3～4 h，回流冷凝收集蒸馏液。用二氯甲烷萃取收集到的蒸馏液，萃取液以无水硫酸钠干燥，过滤，用旋转蒸发仪去除溶剂，得到精油，密封，保存在4℃冰箱中备用。

1.3.2 抑菌活性测试

采用抑制菌丝生长法测试抑制真菌的活性[25]：将样品用一定量的二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成300 mg/mL溶液，加入少许吐温-80，用灭菌的PDA培养基将溶液稀释至2 000、1 000、500、250 mg/L和125 mg/L，使DMSO含量低于0.5%，将带药培养基倒入培养皿中，待其凝固后接入活化后的待测真菌菌饼，每样重复3次，以加入少许吐温-80的等量DMSO溶剂作为空白对照，以三唑酮为阳性对照。置于28℃培养箱中培养6 d，用十字交叉法测量菌落直径，根据菌丝生长抑制率计算抑制中浓度（IC50）[26]。

抑制细菌的活性[27]：将所选测试菌种活化后，用LB液体培养基稀释菌液至0.5麦氏浊度;将样品用一定量的DMSO溶解并用活化后的菌液配制成4 000 mg/L溶液，加入少许吐温-80，使DMSO含量低于1.0%。采用96孔板2倍稀释法测试5种精油的抑制细菌活性，以加入少许吐温-80的等量DMSO的菌液作为空白对照，以环丙沙星为阳性对照。置于37℃培养箱中培养24 h，以孔板上没有浑浊的最小药液浓度为样品对供试细菌的最低抑菌浓度（MIC）。

1.3.3 化学成分分析

气相色谱条件：色谱柱为弹性石英毛细管柱（ZB-5MSI，30 m×0.25 μm×250 μm），用正己烷将植物精油配制成150 mg/L的溶液。测定八角、丁香、生姜、薄荷精油时，程序升温：初始温度为58℃保持2 min，以3℃/min升温速度升至160℃，再以10℃/min的速度升至310℃，八角和丁香处理运行40 min，生姜和薄荷处理运行56 min;孜然处理程序升温：初始温度48℃保持2 min，以4℃/min升温速度升至206℃，再以8℃/min的速度升至310℃，运行35 min;柱子参数：汽化室温度250℃，接口温度280℃，进样量1 μL，载气为99.99%的高纯氦气，丁香、薄荷、八角、生姜精油柱前压均为8.11 psi，孜然柱前压为7.38 psi，载气流量1.0 mL/min，分流比20∶1，溶剂滞后时间4.0 min。5种植物精油的质谱条件：电子能量70 eV，离子源为EI源，EI源温度230℃，发射电流34.6 μA，四极杆温度150℃，倍增器电压1 482 V，质量范围29～500 amu。各峰经质谱计算机数据系统检索，标准图谱库Nist 2005和Wiley 275确定各精油的化合物结构，用峰面积归一化法确定各成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 5种植物精油抑制真菌活性

5种植物精油对8种植物病原真菌的抑制活性测试结果见表1。由表可知，5种植物精油对測试真菌均有不同程度的抑制作用，其中丁香精油活性最好，对梨黑星病菌的作用最强，IC50为93.44 mg/L。其次为孜然精油，其对人参锈病菌的活性最好，IC50为112.28 mg/L。薄荷精油的抑菌作用最弱，对所有测试菌的IC50均高于300 mg/L，其中对梨黑星病菌的活性最差，其IC50为797.04 mg/L。在所有测试精油中，生姜精油对根腐病菌的抑制作用最弱，其IC50为1 279.38 mg/L，但对其他测试真菌的抑制作用较强，对立枯丝核菌的IC50也达到146.83 mg/L。该结果表明5种植物精油具有较为广谱的抑制真菌的作用，但与阳性对照相比活性较差。

2.2 5种植物精油抑制细菌活性

5种植物精油对细菌的抑制作用结果见表2。由表可知，5种植物精油对5种测试细菌均有一定的抑制作用，但远远小于阳性对照环丙沙星。与抑制真菌结果相似，亦是丁香和孜然精油的活性最好，对5种测试菌均有一定的抑制作用。孜然精油对青枯菌的MIC最小，为125 mg/L，丁香精油对青枯菌和枯草芽胞杆菌的MIC均为250 mg/L。八角、生姜、薄荷精油只对部分测试菌具有抑制作用，其中八角精油的活性最差，只对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌具有抑制作用，但MIC均大于1 000 mg/L。

2.3 5种植物精油化学成分分析

GC-MS检测5种植物精油的主要化学成分见表3。八角精油中检测出的化合物含量占总成分的98.97%，其主要成分是茴香脑和茴香醛，茴香脑占53.16%，茴香醛占25.68%。另外，芳樟醇的含量为7.18%，萜品烯醇-4和α-萜品醇的含量分别是2.44%和2.34%。薄荷精油中的化合物含量占总含量的99.30%，其中含量最多的为长叶薄荷酮，含量为15.85%，其次为异薄荷脑，含量为15.21%。薄荷烯酮醚和反-胡椒酮氧化物的含量分别为13.04%和12.66%，异薄荷酮9.07%。丁香精油中化合物较少，其含量占总含量的99.90%，其中含量最多的为丁子香酚，含量达到82.65%，其次为乙酰丁香酚，含量为15.81%，其余的化合物含量均较少。生姜精油检测出的化合物，含量占总含量的74.41%。含量最多的香叶醛，含量为16.80%;其次为橙花醇，含量为11.89%;姜烯的含量为5.93%。孜然精油检测出的化合物占总含量的99.99%。其中茴香甲醛和茴香脑的含量分别是46.06%和38.69%，这2种化合物含量为84.75%，是孜然挥发油中的主要物质。草蒿脑的含量为7.96%，萜品烯和伞花烃的含量分别为2.80%和1.96%。

3 讨论

本文通过水蒸气蒸馏法提取了5种药食兼用植物的精油，采用抑制菌丝生长速率法和96孔板微量稀释法测试了5种植物精油对多种植物病原真菌和细菌的抑制作用。结果表明，5种植物精油对多种植物病原真菌和细菌具有一定程度的抑制作用。

本试验中检测出八角精油中的主要成分是茴香脑（53.16%）和茴香醛（25.68%），对8种测试植物病原真菌均有一定的抑制作用，但对所测细菌的活性较弱或没有抑制作用，该结果与已报道的精油活性相差较大[18-19]。张赟彬等报道了柠檬烯为八角精油中的主要抑菌活性物质[28]，而本试验检测出的柠檬烯含量仅为0.03%。文献报道的主要成分与本文所测相似，但抑菌活性相差较大，推测与柠檬烯的含量有关。

本试验检测出的生姜精油的主要成分是香叶醛（16.80%）和橙花醇（11.89%），对所测的植物病原真菌均有中等强度的抑菌活性，对细菌的抑制作用较弱。文献报道生姜精油的主要成分为α-姜烯[20，29]、β-姜烯[21]、β-水芹烯[30]，本试验检测出的姜烯含量为5.93%，与文献报道含量差距甚远，推测可能是受提取工艺、采摘地点和采摘时节等因素的影响。多篇文章报道了生姜精油具有较强的抑菌活性，推測可能与姜精油中姜辣素、黄酮和多酚成分含量有关[22-23，31-32]，而这些物质本试验中并未检测出，可能这就是本次测试活性较弱的原因。

本试验检测出薄荷精油中的主要化学成分为长叶薄荷酮（15.85%）、异薄荷脑（15.21%），生测结果显示其对植物病原真菌和一些细菌的抑制作用均较弱，且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌没有抑制作用。与本试验检测结果不同，文献报道薄荷精油的主要成分为异佛尔酮[17]、香薷酮[33]、薄荷醇[34]，对一些病原细菌均具有良好的抗菌活性[17，35]，MIC值为5.00%～0.04%[17]。国内亦有多篇文献报道了不同品种、不同产地、不同采摘时间、不同提取方法的薄荷精油的成分及抑菌活性，结果表明薄荷精油中的化学成分相差较大，但均有较好的抑菌活性，推测可能原料品种、产地和提取方法不同导致了成分的差异[36]。

本试验所测孜然精油的主要成分为茴香甲醛（46.06%）和茴香脑（38.69%），而文献报道其主要成分为2-蒈烯-10-醛、枯茗醛、3-蒈烯-10-醛[8-9，24]，这些化合物本次试验均未检出。另外，抑菌活性试验显示孜然精油对测试真菌和细菌均有中等强度的抑制作用，与文献报道相似[11，24，37]，推测孜然精油中有多种成分具有抑菌活性。

本试验检测出丁香精油中含量最多的为丁子香酚（82.68%），其次为乙酰丁香酚（15.81%），与文献报道相似[12]。本试验生测结果显示丁香精油在5种被测精油中抑菌活性最强，该结果与文献报道一致[14-15，37-38]。丁子香酚为丁香中的主要气味物质和抑菌物质[14]，贵州产丁香中丁子香酚的含量高于文献报道，据此可推测贵州产丁香应具有更强的丁香气味及抑菌活性，故其品质更优。

本文研究的5种贵州产药食兼用植物精油的主要成分及抑菌活性虽与报道有差别，但其抑菌作用是毋庸置疑的，它们的活性与阳性对照相比较差，是因为5种植物精油均为粗提物，成分较多，活性物质含量较低，故下一步本实验室将在活性追踪下分离这些植物精油中的活性物质，以期寻找到新的抑菌活性物质。本试验研究结果显示，5种植物精油对多种植物病原微生物具有抑制作用，但本次试验均为体外测试，且精油往往对植物具有化感作用，故这些精油对于植物相关病症的效果，还需进一步的盆栽试验验证。另外，本文中的植物均为人们通常添加到食物中的香料植物，千百年来的食用结果表明这些植物对人体无毒、无副作用，本研究的结果将为食物及食材的保鲜提供新的方法，为天然产物在食品安全领域的应用开发提供理论依据。

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（责任编辑：田 喆）