李玺 肖强 张倩 梁烙琪 卢燕珊 陈明真 欧阳雁弟 荣福

南方医科大学顺德医院(佛山市顺德区第一人民医院)呼吸与危重症医学科528308

我国是结核病高负担国家,仅次于印度,居全球第2位［1］。结核病的主要类型之一结核性胸膜炎是发展中国家最常见的胸腔积液病因［2］,也是不明原因胸腔积液的主要病因之一［3］。造成结核性胸膜炎诊断困难的主要原因是目前的诊断方法敏感性低,胸水涂片找抗酸杆菌的敏感性只有6%,胸水培养结核杆菌的敏感性仅为36.3%［4］,Xpert MTB/RIF诊断结核性胸膜炎的总体敏感性为30%［5］,上述方法对结核性胸膜炎的诊断价值有限;而诊断率高的内科胸腔镜检查属于有创操作,由于技术和条件的限制并没有广泛开展。临床最常用的诊断结核性胸膜炎的生物标志物为腺苷脱氨酶,以腺苷脱氨酶≥45 U/L 作为诊断标准,其敏感性仅为36.7%［6］,且腺苷脱氨酶的水平还受年龄的影响［7］。准确诊断对于控制结核病很重要,但2019年全球结核报告指出在结核诊断技术方面目前还没有什么新的突破［1］,因此提高结核性胸膜炎的诊断水平需寻求新的方法和手段。环状RNA(circular RNA,circRNA)具有独特的环状结构,具有高度稳定性、组织丰富性和疾病特异性等特点［8］,在转录、转录后及翻译调控中起着潜在作用,这使得circRNA 作为新型临床诊断标志物成为可能。本研究分析结核性胸膜炎与非结核非肿瘤患者胸膜组织中的circ RNA 表达谱变化,分析两者的差异并预测其相关靶基因,初步探索circRNA与结核性胸膜炎的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年3-11月在南方医科大学顺德医院(佛山市顺德区第一人民医院)住院的经内科胸腔镜胸膜活检,病理确诊为结核性胸膜炎患者13例为实验组;13例对照组标本来自经病理确诊为肺部慢性炎性结节或支气管扩张症患者在行胸腔镜检查时留取的正常胸膜组织。纳入标准:年龄＞18岁,既往无结核或肿瘤病史,未行诊断性抗结核治疗,常规胸穿抽液送检未能明确胸腔积液病因,签署知情同意书后行胸腔镜检查。排除标准:妊娠或哺乳期妇女,既往有结核或肿瘤病史,曾行诊断性抗结核治疗,患有其他严重疾病者,不能耐受内科胸腔镜检查者,未签署知情同意书者。标本-80 ℃冻存。实验组和对照组分别随机选取3份标本行高通量测序,其余10份标本行实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证。本研究经医院伦理委员会批准且患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 高通量测序及数据分析 (1)RNA 样品抽取:采用Magen Hipure Total RNA Mini Kit并根据试剂盒说明书对3例胸膜转移癌组织及癌旁正常组织进行总RNA 的抽提,抽提所得的总RNA取样质检。(2)RNA 样品质检方法:琼脂糖凝胶电泳分析RNA 降解程度,判断是否有基因组污染;Qubit 3.0检测RNA 样品浓度;Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA 的完整性。 (3)文库构建:样品质检合格后,使用Total RNA-seq Library Prep Kit for Illumina®构建文库,先将设计好的DNA 探针与RNA 样品进行杂交,从而将r RNA从总RNA 中去除;随后将RNA 进行片段化,合成cDNA 第一链,采用链特异的方法,在第二链cDNA 合成时掺入d UTP 对其进行标记,同时在此步完成了末端修复;接着进行加A-尾、连接接头、连接产物纯化和片段大小分选、文库扩增等步骤,在PCR 扩增前用UDG 酶消化带d UTP 第二链模板,扩增结束后用磁珠纯化回收即得RNASeq文库。 (4)文库质控:先使用Qubit 3.0进行初步定量,随后使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库大小范围进行检测,插入的目的片段大小符合预期后,使用qPCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞3 nmol/L),以保证文库质量。(5)上机测序。

1.2.2 差异表达的circRNA 进行q RT-PCR 验证 用edgeR 对高通量测序结果进行了circ RNA差异表达分析(差异倍数＞1.5,P＜0.05),从筛选出的差异circ RNA 中选择6 个circRNA 进行qRT-PCR 验证。引物序列见表1。按TRIzol®试剂说明书提取总RNA;利用反转录试剂盒将RNA逆转录为cRNA,反应条件为25℃10 min,42℃15 min,85 ℃5 min;采用SYBR Green法qRTPCR 验证,反应条件为95 ℃5 min,95 ℃10 s,60 ℃34 s,40个循环,扩增结束后按95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s建立溶解曲线。GAPDH 基因作为内参基因,根据2-ΔΔCt公式计算目标基因表达情况。

表1 引物序列

1.2.3 生物信息学分析 利用miRanda软件,根据比对得分＞150、自由能＜-20,预测差异表达circ RNA 的微小RNA (micro RNA,miRNA)。

1.3 统计学分析 使用SPSS 17.0 for Windows软件对2-ΔΔCt值进行统计学分析。所有计量数据均进行正态性检验,以x-±s表示,2组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高通量测序结果 筛选实验组与对照组的胸膜组织的circRNA 表达水平,发现存在差异表达的circ RNA 有134个,其中53个表达上调,81个表达下调,部分结果见表2。差异倍数＞1.5,P＜0.05。根据差异表达分析结果绘制火山图和热图(图1、2)。

表2 高通量测序筛查表达上调和表达下调的部分环状RNA

图1 环状RNA 火山图

图2 差异表达环状RNA 热图

2.2 miRNA-circRNA 关系预测 利用miRanda软件,根据比对得分＞150,自由能＜-20 得到miRNA-circ RNA 关 系,circRNA 序 列 上 的miRNA 结合位点数目越多,那么miRNA 就更有可能结合到circRNA 上。因此,对miRanda结果进行了过滤,保留了结合位点数目≥2的miRNAcircRNA 关系,绘制了miRNA-circRNA 调控网络图(图3)。

图3 miRNA-circ RNA 调控网络图

2.3 差异表达的circ RNA 的qRT-PCR 验证结果 通过对高通量测序结果筛选处理得到差异表达的circ RNA 中挑选3个显著上调的circ RNA hsa_circ_0008433、hsa_circ_0009142、hsa_circ_00033144和3个显著下调的circ RNA hsa_circ_0008234、hsa_circ_007342、hsa_circ_0001368

进行qRT-PCR验证。结果显示,实验组hsa_circ_0008433的表达水平显著高于对照组(P＜0.05),实验组hsa_circ_0008234、hsa_circ_0001368的表达水平显著低于对照组 (P＜0.05),结果与高通量测序结果一致。其余3个circRNA 的表达水平差异无统计学意义。见图4～6。

图4 实验组和对照组hsa_circ_0008433差异表达的散点图

2.4 差异表达的circ RNA 的靶基因预测 利用miRanda软件,分别预测hsa_circ_0008433、hsa_circ_0008234、hsa_circ_0001368 的可能相互作用的miRNA,列出每一个circ RNA 的前面5个miRNA。见表3。

图5 实验组和对照组hsa_circ_0008234差异表达的散点图

图6 实验组和对照组hsa_circ_0001368差异表达的散点图

3 讨论

44 年 前 circRNA 在 RNA 病 毒 中 被Kolakofsky发现［9］,当时并没有被重视。近年来,随着转录组技术的发展,大量的circRNA 被发现在人体内执行多种重要的生物学功能［10］。circRNA呈环状闭合结构,拥有高度保守性、稳定性和细胞特异性［11］,表明circRNA 可作为潜在的生物标志物或治疗靶点［12］。迄今为止,已有多项研究表明circRNA 与肺结核的发生发展相关。孙畅等［13］研究发现,在结核病外周血中has_circ_0090508的表达量显著下降。黄自坤等［14］研究认为血浆hsa_circ_0009024有望作为肺结核诊断的潜在生物标志物。Qian等［15］研究认为联合检测外周血单个核细胞7个circRNA 可以作为活动性肺结核的潜在诊断标志物。

本研究从结核性胸膜炎组织筛选出差异表达的circRNA有134个,其中53个表达上调,81个表达下调。circ RNA 表达谱的变化提示circ RNA 参与了结核性胸膜炎发病机制的调控,表明circRNA可能是结核性胸膜炎的潜在且独特的生物标志物。为进一步确认circRNA 在结核性胸膜炎组织和正常胸膜组织的表达差异,笔者从差异倍数＞1.5的存在统计学差异的基因中选择了3个上调基因和3个下调基因进行qRT-PCR 验证。结果显示,hsa_circ_0008433在结核性胸膜炎组织的表达水平显著高于对照组,hsa _ circ _ 0008234、hsa_circ_0001368在结核性胸膜炎组织的表达水平显著低于对照组,结果与高通量测序结果一致。qRT-PCR 验证了高通量测序的结果,为进一步深入研究提供了方向,有可能筛选出在结核性胸膜炎发生发展中起重要调控作用的circRNA。但本研究存在不足之处,本研究为结核性胸膜炎circRNA表达谱的初步分析研究,肿瘤性胸膜转移是否出现类似的改变尚未可知,需进一步研究明确。

表3 可能与circRNA 相互作用的miRNA

miRNA 是短链非编码RNA,越来越多的研究表明,circRNA 能够与miRNA 竞争性结合,从而影响miRNA 及下游靶基因的表达［16］。本研究对差异表达的hsa_circ_0008433、hsa_circ_0008234、hsa_circ_0001368 进行生物信息学分析,发现hsa_circ_0008234可能与hsa-miR-17、hsa-miR-20b-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-320b 等miRNA 相互作用。朱恩东［17］研究表明,miR-20b在体外可以抑制Th17细胞的分化,并且这种抑制作用不依赖Th17细胞的增殖或凋亡;在体内可能通过抑制靶基因STAT3和RORγt表达抑制Th17细胞的分化生成。人体对结核分枝杆菌的免疫应答主要依赖于T 细胞介导的细胞免疫,笔者推测hsa_circ_0008234 表达的下调可能导致对miR-20b负调控减弱,miR-20b抑制了Th17 细胞的分化生成,可能更容易发生结核性胸膜炎。人体在抗结核菌感染的过程中主要依靠细胞免疫;自噬溶酶体吞噬进入细胞内的结核分枝杆菌是人体清除结核分枝杆菌的重要方式之一。张益源等［18］研究发现,感染结核分枝杆菌后有多种miRNA 包括miR-17-5p和miR-20a-5p等上调,这些miRNA 可导致自噬基因的m RNA 降解,进而影响自噬溶酶体的生成,使得结核分枝杆菌在细胞内避免被清除,最终存活下来［19-20］。hsa_circ_0008234有多个miRNA 结合位点,可以像海绵般吸附miRNA,hsa_circ_0008234 的表达下调可能会对上述miRNA 的抑制作用减弱,导致Th细胞分化和自噬作用受影响,进而削弱机体对结核分枝杆菌的细胞免疫功能,引起结核性胸膜炎的发生发展,这对结核性胸膜炎的发病机制提出了一个新的方向,但还需要下一步的研究验证。

综上所述,结核性胸膜炎患者胸膜组织中circRNA 表达谱发生了变化,这些差异表达的circRNA 可能参与了结核性胸膜炎发生发展的调控,hsa_circ_0008433、hsa_circ_0008234 和hsa_circ_0001368有望成为结核性胸膜炎的诊断标志物。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突