张世霞，李聚林，冯五金

(1. 山西中医药大学,山西 晋中 030619； 2. 山西省中医院,太原 030012)

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。目前，放疗、化疗等治疗方式在一定程度上提高了胃癌患者的生存率，但常规的化疗药物存在易复发、毒副作用大等缺点[1]。中国传统的中草药具有广泛的药用价值，且具有安全、高效、副作用低等优点，是抗肿瘤药物的研究热点之一[2]。小檗碱是中药黄柏、黄连的主要成分，又名黄连素，具有消炎、降血脂、抗氧化等作用[3]。研究显示，小檗碱可通过抑制肿瘤细胞生长、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用[4-5]。Wnt/β-catenin信号通路是一种重要的细胞内信号传导通路，在机体正常生理功能维持和疾病发生中均有调控功能[6]。Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤中异常激活，其关键蛋白β-catenin和下游靶基因c-myc过度表达，抑制其激活后可通过影响肿瘤细胞的生物学特性抑制肿瘤的发生发展[7-8]。研究报道称，小檗碱可抑制结肠癌等癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路激活，二者之间可能存在一定联系[9]。本研究旨在明确小檗碱和Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞MKN45增殖、凋亡及糖代谢的影响，为小檗碱和Wnt/β-catenin信号通路抑制剂治疗胃癌提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与实验试剂

胃癌细胞(MKN45，美国ATCC)；胎牛血清(杭州四季青)；青霉素、RPMI1640培养基、链霉素、噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT，美国Sigma)；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Cleaved Caspase-3)抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、单克隆抗体、β-连环蛋白(β-catenin)抗体、c-myc抗体(美国Abcam)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)，蛋白定量试剂盒 (PA115，北京TIANGEN)；细胞总蛋白抽提试剂盒(P1250，北京普利莱)；乳酸含量检测试剂盒(南京森贝伽)；丙酮酸激酶活性检测试剂盒(武汉艾美捷)；己糖激酶活性检测试剂盒(北京索莱宝)；膜联蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium Iodide,PI)凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物公司)。

1.2 细胞培养

MKN45细胞从液氮中取出后37 ℃快速溶解，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液，于饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养。细胞生长密度超过80%以后吸弃上清液，0.25%胰蛋白酶消化后以1∶2的比例进行传代，继续培养用于后续实验。

1.3 小檗碱对MKN45细胞增殖影响

MKN45细胞培养至对数期后，接种于96孔细胞培养板中，每孔2000个细胞。培养过夜后弃培养液，分别加入含小檗碱终浓度0、6、12、24、48和96 μmol/L的细胞培养液，每个浓度设置5个复孔。继续培养48 h后加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培养箱中继续孵育4 h。弃上清液每孔加入150 μL二甲基亚砜，充分溶解结晶物后混合均匀，于酶标仪492 nm波长处测定吸光度值(absorbance,A值)，计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concertration,IC50)，实验重复3次取均值。

1.4 细胞分组

MKN45细胞分为对照组、小檗碱组、FH535组和联合组。小檗碱组终浓度24 μmol/L小檗碱作用于MKN45细胞48 h；FH535组20 μmol/L Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535作用于MKN45细胞48 h；联合组24 μmol/L小檗碱与20 μmol/L FH535共同作用于MKN45细胞48 h，对照组中不加任何药物。

1.5 细胞凋亡检测

细胞分组培养后，胰蛋白酶消化，PBS清洗细胞并调整浓度为6×105个/mL。吸取1 mL细胞悬浮液，1000rpm离心10 min。弃上清液，加入200 μL结合缓冲液重悬细胞。再依次加各5 μL的碘化丙啶(propidium Iodide,PI)和膜联蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)，室温避光孵育15 min，在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次取均值。

1.6 糖酵解水平检测

细胞分组培养后收集细胞及培养液上清，用乳酸含量检测试剂盒检测上清中的乳酸水平，用丙酮酸激酶活性检测试剂盒和己糖激酶活性检测试剂盒分别检测细胞中的丙酮酸激酶和己糖激酶活性。用实验组与对照组的比值作为乳酸相对含量、丙酮酸激酶相对活性和己糖激酶相对活性，实验重复3次取均值。

1.7 β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平检测

细胞蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取适量蛋白样品加入等体积的上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min使蛋白变性。5%浓缩胶和12%分离胶进行蛋白电泳。电泳后转膜，37 ℃、5%脱脂奶粉孵育1 h。然后分别加入β-catenin(稀释度1∶500)、c-myc(稀释度1∶800)、Cleaved Caspase-3(稀释度1∶600)抗体，4 ℃孵育过夜。次日加入二抗(稀释度1∶2000)，37 ℃孵育反应1 h。加入ECL显影，采用Bio-Rad采集图像。以GAPDH为参照，Quantity One软件分析蛋白表达水平，实验重复3次取均值。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 小檗碱对MKN45细胞增殖的影响

表1示，与未使用小檗碱作用的MKN45细胞比，小檗碱作用MKN45细胞后吸光度值明显降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，表明小檗碱可剂量依赖性地抑制MKN45细胞增殖。经计算小檗碱作用MKN45细胞的IC50值为(24.38±2.81)μmol/L，因此选用24 μmol/L的小檗碱用于后续实验。

表1 小檗碱作用后MKN45细胞A值变化比较

2.2 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂对MKN45细胞增殖的影响

表2示，与对照组比较，小檗碱组、FH535组、联合组细胞A值均显著降低(P<0.05)。与小檗碱组或FH535组比较，联合组细胞A值显著降低(P<0.05)，表明小檗碱和抑制Wnt信号通路均能够抑制MKN45细胞增殖，且二者具有协同作用。

表2 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂作用后MKN45细胞A值变化

2.3 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂对MKN45细胞凋亡的影响

图1表3示，与对照组比较，小檗碱组、FH535组、联合组细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)。与小檗碱组或FH535组比较，联合组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，表明小檗碱和抑制Wnt信号通路均能促进MKN45细胞凋亡，且二者具有协同作用。

图1 流式细胞术检测MKN45细胞凋亡

表3 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂作用后MKN45细胞凋亡率变化比较

2.4 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂对MKN45细胞糖酵解的影响

表4示，与对照组比较，小檗碱组、FH535组、联合组细胞丙酮酸激酶、己糖激酶及乳酸相对含量均显著降低(P<0.05)。与小檗碱组或FH535组比较，联合组细胞丙酮酸激酶、己糖激酶及乳酸相对含量均显著降低(P<0.05)，表明小檗碱和抑制Wnt信号通路均能抑制MKN45细胞糖酵解，且二者具有协同作用。

2.5 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂对胃MKN45细胞β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平的影响

表4 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂作用后MKN45细胞糖酵解相关指标变化比较

图2表5示，与对照组比较，小檗碱组、FH535组、联合组MKN45细胞β-catenin和c-myc蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与小檗碱组或FH535组比较，联合组MKN45细胞β-catenin和c-myc蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，表明小檗碱能够抑制MKN45细胞中Wnt信号通路的激活，促进Caspase-3活化。

图2 Western blot检测β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平

表5 小檗碱和Wnt信号通路抑制剂作用后MKN45细胞β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平变化比较

3 讨论

小檗碱常用来治疗胃肠道疾病，具有较长的用药历史。随着研究的深入发现，小檗碱可通过抑制细胞增殖、干扰细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制细胞转移等发挥抗肿瘤作用[10]。研究显示，不同浓度的小檗碱作用胃癌细胞后可抑制胃癌细胞增殖，并诱导其凋亡[11-12]。本研究结果显示，小檗碱作用后，胃癌细胞增殖活性下降，凋亡率升高。这与之前的研究报道结果一致。

Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤发展有关，在肿瘤细胞增殖、凋亡等过程中具有重要作用。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键调控蛋白，在肿瘤中表达下调[13]。Wnt的配体、卷曲蛋白、低脂密度蛋白相关受体可以特异性地结合形成复合物，激活Wnt/β-catenin信号通路，促使散乱蛋白磷酸化，抑制β-catenin磷酸化，而未被磷酸化的β-catenin不能与蛋白复合物特异性识别，从而导致β-catenin进入到细胞核，促进下游靶基因c-myc的表达[14-16]。何百成等[17]通过运用嵌合体报告质粒发现，小檗碱可以抑制细胞中β-catenin的激活。本研究结果显示，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂可抑制胃癌细胞生长，促进胃癌细胞凋亡。小檗碱或Wnt/β-catenin信号通路抑制剂均可降低胃癌细胞中β-catenin和c-myc表达，且两者联合作用效果更明显，提示小檗碱通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肿瘤作用。

癌细胞具有与正常细胞不同的能量代谢途径，正常细胞只有在缺氧条件下通过糖酵解途径供能，而肿瘤细胞无论是在氧气充足还是氧气不足的条件下都优先以糖酵解方式进行能量代谢，这被称之为“有氧糖酵解”[18-20]。己糖激酶、丙酮酸激酶是糖酵解途径中的关键限速酶，其活性越高糖酵解速度越快[21]。乳酸是糖酵解的产物之一，检测其含量的高低可以间接反映细胞内糖酵解水平[22]。研究显示，小檗碱可以抑制乳腺癌细胞能量代谢水平，Wnt/β-catenin影响胰腺癌细胞糖酵解水平[23-24]。本研究表明，小檗碱或Wnt/β-catenin信号通路抑制剂作用后胃癌细胞中己糖激酶、丙酮酸激酶活性均降低，培养液上清中乳酸含量也降低，表明小檗碱或Wnt/β-catenin信号通路抑制剂可降低胃癌细胞糖酵解水平，且二者联合作用效果更好，提示小檗碱通过抑制Wnt/β-catenin信号通路干扰胃癌细胞糖酵解。

总之，小檗碱和Wnt/β-catenin信号通路抑制剂均能抑制胃癌细胞增殖和糖酵解，促进细胞凋亡，二者联合后抗肿瘤作用更为明显。此外，小檗碱可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活发挥作用，为其用于胃癌的治疗提供理论依据。