李勤祥，潘爱珍，徐志锋，金亚彬，刘伟涛，徐文锋

（佛山市第一人民医院，广东 佛山 528000）

泌尿系结石是泌尿外科最常见疾病之一，近年，随着人们生活环境及饮食习惯的不断改变，其发病率有上升趋势，且复发率也相对较高，给患者造成一定的困扰[1-2]。因此寻找相关原因，探求解决办法一直是临床工作者关注的重点。有研究显示，泌尿系结石复发与结石成分密切相关，而后者又与基因遗传学明显相关，但具体基因分析研究较为少见[3]。钙敏感受体（Calcium sensing receptor，CaSR）基因位于人染色体3q13.3-21上，其编码蛋白是一种重要的G蛋白偶联受体，在钙离子调节中占有重要地位[4]。CaSR基因共有7个外显子，而CaSR986则是位于第7个外显子中的某个单核苷酸，其主要功能是编码细胞外域和跨膜的钙敏感受体蛋白，可导致含钙结石形成[5]。结石成分不同，其治疗方法不尽相同，目前术后体外红外光谱分析法是结石成分分析的金标准，限制了术前对结石成分的准确判断从而影响个体化治疗方案的制定，近年来能谱CT双能量扫描可弥补此不足，可在体内完成此项检查，为结石成分分析提供了一个新的平台[6-7]。本研究选取我院收治的98例泌尿系结石患者和50例健康者作为研究对象，探讨CaSR986基因多态性与泌尿系结石成分及临床特征的相关性，旨在为临床个体化治疗提供更多理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月—2017年7月于我院收治的98例泌尿系结石患者作为研究对象，称为实验组，纳入标准为：①临床表现、实验室及影像学检查均提示为泌尿系结石，且为首次诊疗者；②年龄在18～50岁之间，且均须经皮肾镜或输尿管镜取石术者；③术前行双能源CT双能量扫描，术后行红外光谱分析者；④临床及随访资料完整者。排除标准：①术前双能CT和术后红外光谱结果分析差异者；②怀孕者或合并泌尿系恶性肿瘤者；③期间或近半年参加相关研究者；④具有精神病史或家族史者；其中男56例，女42例；平均年龄（34.98±6.18）岁；地区分布：本地长期生活达10年者65例；其它33例。收集同期于我院进行体检的50例健康者作为对照组，排除具有泌尿系结石家族史者；其中男28例，女22例；平均年龄（35.08±6.69）岁；地区分布：本地长期生活达10年者34例；其它16例。两组在性别、年龄及地区分布等一般资料上差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 CaSR986基因多态性检测

1.2.1 血液标本收集及保存

嘱所有患者于入组当天抽取5 mL外周静脉血（EDTA抗凝），3 000 r/min低温高速离心10 min，转移上清液至1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存，待所有标本集齐后进行后续检测。

1.2.2 DNA提取

参考外周血基因组DNA提取试剂盒 （美国Merck公司）操作说明书完成DNA提取，后采用GENESYSTM180紫外分光光度仪（美国Thermo Fisher公司）检测其浓度、纯度，质量合格者进行后续实验。

1.2.3 PCR引物设计

参考Gene Bank中CaSR基因中第7外显子986突变位点上下游序列，使用Primer 6.0软件完成引物设计，后由上海吉凯基因化学技术有限公司完成其合成和测序验证，序列正确。其中上游引物序列为5’-CAGAAGGTCATCTTTGGCAGCGGCA-3’，下游引物序列为5’-TCTTCCTCAGAGGAAAGGAGTCTGG-3’。

1.2.4 PCR扩增

反应体系：①总体积50 μL；②内容物：4μLDNA模板、各4 μL上下游引物（0.5 μmol/L）、4 μL dNTP混合液 （200 μmol/L）、0.5 μLTaqDNA聚合酶（5U）、4 μL Mgcl2（1.5 mmol/L）及28.5 μL Buffer；③反应条件：按95℃10 min预变性、95℃30 s变性、60℃1 min退火、72℃1 min延伸，共40个循环，最后72℃ 10 min终末延伸。其中产物片段长度为450bp。

1.2.5 CaSR986基因多态性分析

参考PCR产物纯化试剂盒（购于美国Merck公司）操作说明书完成PCR产物纯化和回收，后将其送至上海吉凯基因化学技术有限公司测序。

1.3 结石成分分析

术前，采用宝石能谱 CT （Discovery CT 750HD，GE Healthcare）对实验组患者体内结石进行检查，扫描范围为双肾上极至耻骨联合水平；扫描参数：GSI模式，扫描管电压120 kVp，管电流150 mAs，探测器准直0.625 mm×64 mm，螺距0.984，球管转速1 s/r，DFOV 12 cm，矩阵512×512。原始数据传至GEAW 4.6工作站，由1名有多年工作经验的放射科医师在GSI模式下测量所有结石的有效原子序数（Eff-Z）。选取结石最大层面手工勾画感兴趣区（ROI），尽可能包含结石，依据Eff-Z峰值和能谱曲线按照国家标准与技术研究所（NIST）已知物质进行比较判定结石主要成分。术后，采用LIIR-20红外光谱自动分析仪（天津蓝莫德科学仪器有限公司）对实验组患者取出结石进行成分分析。

在本研究中，主要将结石成分分为两类：含钙结石和非含钙结石两种类型。

1.4 随访

术后，对实验组患者随访1年，每次间隔2月，主要通过电话、微信、上门和入院复查等方式进行。对疑似复发者嘱其立即入院完成相关检查，尤其强调行能谱CT复查其再发结石成分。

1.5 统计学方法

本研究所有数据均采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，其中基因频率分布采用Hardy-Weinberg平衡检验；计数资料用构成比（%）描述，用χ2或Fisher精确检验比较；采用Pearson法分析CaSR986基因型分布与结石成分之间的关系；采用Logistic回归法分析影响结石复发的独立危险因素；按α=0.05的检验水准；以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验

实验组和对照组中发现CaSR986基因有AA、AS和SS三种基因型，以AA纯合子基因型比较高；采用拟和优度卡方检验分析其基因频率分布，符合Hardy-Weinberg定律（P>0.05），具有群体代表性。

2.2 两组CaSR986基因多态性比较

CaSR986基因型及等位基因构成比在实验组和对照组差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表1。

2.3 实验组结石成分分析

在本研究中，实验组含钙结石75例（图1），非含钙结石23例（图2）。

2.4 CaSR986基因型与结石成分相关性分析

经Pearson相关性分析得知，含钙结石与CaSR986 AA型呈现明显正相关（r=0.734，P<0.05）；而含钙结石与CaSR986其它基因型、非含钙结石与CaSR986任何基因型均无明显相关性（P>0.05）。

2.5 CaSR986基因型与临床特征之间的关系

CaSR986基因型分布在结石部位、结石复发及复发结石成分上差异具有统计学意义（P<0.05）：其中AA型与肾结石、AS型与膀胱结石及SS型与尿道结石相关性较大；AA型与结石复发及含钙结石成分密切相关，但在结石直径及肾积水方面差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表2。

2.6 泌尿结石复发Logistic回归分析

将年龄、性别、结石部位、结石成分、结石直径、肾积水情况及CaSR986基因型纳入Logistic回归分析发现：结石部位、结石成分及CaSR986基因型与泌尿结石复发相关（P<0.05），在校正性别及年龄混杂因素后再次进行Logistic回归分析后发现结石成分是影响泌尿结石复发的独立危险因素（P<0.05）。

表1 两组CaSR986基因多态性比较

图1，2 HDCT结石成分分析结果图。图1为含钙结石（草酸钙结石），图2为非含钙结石（尿酸结石）。Figure 1,2.The results of HDCT stone composition analysis.Figure 1:Calcium-containing calculus (calcium oxalate stone),Figure 2:Non-calcium stone(uric acid stone).

表2 CaSR986基因型与临床特征之间的关系

3 讨论

泌尿结石发生及复发机制截止目前仍不十分清楚，可能与环境因素、遗传因素及个体因素等有关[8]。目前有学者认为遗传因素在其中占有一定地位，且与结石成分相关[9]。CaSR基因可在人体各个组织中分布，以肾脏和甲状旁腺为主，在感应细胞外钙离子变化后通过介导甲状旁腺激素 （Parathyroid hormone，PTH）释放和促进肾小管细胞对钙的吸收，在保证体内钙平衡方面占有重要地位[10]。大部分学者认为肾脏钙调节功能与泌尿系含钙结石形成密切相关，进一步研究发现CaSR是影响尿钙重吸收的重要基因之一，基因形态不同其相关性有所差异[11-12]。在CaSR基因第7个外显子中包含3个单核苷酸（Single nucleotide polymorphisms，SNP），分别为986S、990G和1011Q，均可导致含钙结石形成，基因多态性不同，可呈现不同结果[13]。能谱CT是近年来医学影像学发展史上又一突破，可在治疗前大致了解结石成分，为其治疗方案的选择提供了方向，有效提高了其治愈率[14]。

本研究则主要针对CaSR986基因，探讨其多态性与能谱CT泌尿系结石成分分析结果及临床特征的相关性。本研究完成了98例泌尿系结石和50例健康体检者外周血血清的DNA测序，发现两组CaSR986基因分布符合Hardy-Weinberg定律，且均以AA纯合子最为常见，这与国内外主要观点一致[15-16]。两组CaSR986基因基因型及等位基因构成比比较差异无统计学意义（P>0.05），但经Pearson相关性分析得知，含钙结石与CaSR986 AA型呈现明显正相关 （r=0.734，P<0.05），提示含钙结石形成与CaSR986基因密切相关，其具体调控机制未在本实验中得到探讨，有待后续继续研究。此外，本研究通过分析CaSR986基因型与临床特征之间关系发现CaSR986基因型分布在结石部位、结石复发及复发结石成分上差异具有统计学意义（P<0.05），提示临床工作者可通过检测患者CaSR986 SNP，帮助发现隐秘部位细小结石和预测患者预后，具有一定临床价值。

最后，本研究还进行了泌尿结石复发Logistic回归分析，发现结石成分是影响泌尿结石复发的独立危险因素（P<0.05），提示临床工作者应该关注泌尿系结石患者结石成分的准确分析，与前面结论联合再次强调了基因多态性与宝石能谱CT联合检测在泌尿系结石诊疗及预后监测中的重要意义。

综上所述，宝石能谱CT可在术前分辨含钙结石，对泌尿结石复发预测具有一定价值，与CaSR986 AA基因型密切相关。