杨滨，王海乐

1.华北石油二部医院 中医科，河北 任丘 062552；2. 湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410001

糖尿病是当今社会严重危害人类健康的十大疾病之一，是一种因胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病，具有多食、多饮、多尿、消瘦等“三多一少”的典型临床症状，其发病与患者年龄、文化程度、职业、环境及遗传等因素相关，中医将其归属为“消渴病”。通脉降糖胶囊现收载于国家药品监督管理局国家药品标准WS-11213(ZD-1213)-2002-2012Z，由黄芪、太子参、绞股蓝、丹参、黄连、葛根等11味中药加工而成，主要用于气阴两虚、脉络瘀阻所致的消渴病(糖尿病)，证见神疲乏力、肢麻疼痛、头晕耳鸣、自汗等病症的治疗[1]。现代研究表明，通脉降糖胶囊可显著降低患者全血黏度[2]，对糖尿病肾病[3-4]、糖尿病周围神经病变[5-7]、改善2型糖尿病并脑梗死恢复期患者预后[8-9]，临床治疗效果显著。中药制剂具有多组分、多靶点和整体调节的特点，现有的单组分质量评价模式难以全面评价中药制剂的内在质量，多指标成分评价模式已逐步应用于制药及其制剂的质量控制中，通脉降糖胶囊现行质量标准仅对方中臣药黄连所含盐酸小檗碱进行单成分定量控制，未对方中君药黄芪、玄参及其他药物所含成分进行定量研究，也未检索到对通脉降糖胶囊多组分质量控制的文献报道。本文采用HPLC梯度洗脱法，参考中药质量标志物确定原则，选取方中君药黄芪的活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素，臣药太子参的活性成分太子参环肽B，佐药绞股蓝的特征成分绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ为检测目标成分，实现对通脉降糖胶囊中多个组分的同时测定，为进一步完善通脉降糖胶囊质量标准，确保其产品质量的稳定性和临床治疗效果的一致性提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-2010型高效液相色谱仪、AUW120D型电子天平(日本岛津公司)；YQ-1000A型超声波清洗器(上海易净超声波仪器厂)。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111920-201606，CAS号：20633-67-4，纯度：97.6%)；芒柄花苷对照品(批号：PRF8081121，CAS号：486-62-4，纯度：99.6%)、芒柄花素对照品(批号：PRF8091225，CAS号：485-72-3，纯度：99.9%)、绞股蓝皂苷XLIX对照品(批号：PRF8040744，CAS号：94987-08-3，纯度：99.5%)、绞股蓝皂苷ⅩⅦ对照品(批号：PRF8092143，CAS号：80321-69-3，纯度：97.7%)均来源于成都普瑞法科技开发有限公司；太子参环肽B对照品(上海同田生物技术股份有限公司,批号：18031328，CAS号：145459-19-4，纯度：99.9%)；绞股蓝皂苷A对照品(武汉天植生物技术有限公司,批号：CFS201702，CAS号：157752-01-7，纯度：98.0%)；通脉降糖胶囊(保定天浩制药有限公司，规格：每粒装0.4 g，批号分别为：181103、181202、190403)；乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ对照品各适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.752、0.438、1.024、0.172、1.596、1.718、2.392 mg·mL-1的7个对照品储备液；精密量取7个对照品储备液各2.5 mL，用甲醇制成质量浓度分别为37.6、21.9、51.2、8.6、79.8、85.9、119.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液 取通脉降糖胶囊样品适量，倾出内容物，混匀，取2.0 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，密塞，称质量，YQ-1000A型超声波清洗器超声处理30 min，取出，放冷，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，续滤液作为通脉降糖胶囊供试品溶液。

2.1.3阴性样品溶液 按通脉降糖胶囊制剂处方比例和制法，分别制备缺黄芪、缺太子参和缺绞股蓝的3种阴性样品，再按2.1.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及专属性试验

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：25 ℃；流动相乙腈(A)-0.3%甲酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10.0 min，9.0%A；10.0～25.0 min，9.0%～20.0%A；25.0～36.0 min，20.0%～32.0%A；36.0～51.0 min，32.0%～40.0%A；51.0～60.0 min，40.0%～9.0%A)；体积流量：1.0 mL·min-1；检测波长分别为260 nm[10-11](0～25.0 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素)和203 nm[12-15](25.0～60.0 min检测太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ)；进样量：10 μL。精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液以及2.1.2、2.1.3项下制备的各溶液适量，依法进样检测，记录所检测色谱图。结果所记录色谱图基线平稳，通脉降糖胶囊供试品溶液色谱图中待测成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ与其他杂质成分均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按所测成分计均不低于4500，阴性样品对通脉降糖胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的同时测定无干扰，色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.供试品；C.黄芪阴性样品；D.太子参阴性样品；E.绞股蓝阴性样品；1. 毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2. 芒柄花苷；3. 芒柄花素；4. 太子参环肽B；5. 绞股蓝皂苷XLIX；6. 绞股蓝皂苷A；7. 绞股蓝皂苷ⅩⅦ。图1 通脉降糖胶囊及对照品、阴性样品HPLC图

2.3 线性关系考察

精密吸取2.1.1项下7个对照品储备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于6个20 mL量瓶中，用甲醇制成各待测成分25倍质量浓度差的6个混合对照品溶液，依法进样检测，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的峰面积，以质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液连续进样6次，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的峰面积，结果待测目标成分峰面积的RSD分别为1.16%、1.21%、0.99%、1.37%、1.01%、0.69%和0.53%。

2.5 重复性试验

取通脉降糖胶囊同一批次样品适量，按2.1.2项下方法平行制备6份通脉降糖胶囊样品溶液，依法进样测定，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的峰面积，计算各待测目标成分含量。结果7个待测目标成分含量的RSD分别为1.44%、0.72%、1.56%、0.87%、1.24%、1.02%和0.96%。

2.6 稳定性试验

取通脉降糖胶囊样品同一份供试品溶液(临用新配)，于制备后0、2、4、6、10、12 h依法进样检测，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的峰面积。结果通脉降糖胶囊供试品溶液12 h内稳定，7个待测目标成分峰面积的RSD分别为1.19%、1.25%、1.03%、1.40%、0.98%、0.72%和0.57%。

2.7 加样回收率试验

取同一批次已知含量的通脉降糖胶囊样品适量，倾出内容物，混匀，取9份，每份1.0 g，随机分成3组，精密称定，按《中华人民共和国药典》2015年版四部要求精密加入另行配制的混合对照品溶液(毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ质量浓度分别为0.209、0.127、0.374、0.048、0.443、0.615、0.849 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，再按2.1.2项下方法制备加样供试品溶液，依法进样测定，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的加样回收率，结果见表2。

2.8 样品含量测定

取通脉降糖胶囊3批样品适量，倾出内容物，混匀，取2.0 g，精密称定，按2.1.2项下方法每个批次平行制备通脉降糖胶囊供试品溶液3份，依法进样检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的峰面积，分别计算7个待测目标成分的含量，结果见表3。

表1 通脉降糖胶囊中7种成分线性关系考察试验结果

表2 通脉降糖胶囊样品中7种成分的加样回收率(n=9)

续表2

表3 通脉降糖胶囊样品中7种成分含量测定结果(n=3) mg·g-1

3 讨论

3.1 待测目标成分的选择

通脉降糖胶囊由黄芪、太子参、绞股蓝、丹参、黄连、葛根、山药、苍术、玄参、水蛭、冬葵果11味中药组方而来，方中黄芪补气固表、生津养血，玄参清热凉血、滋阴散结，合为君药；太子参益气生津，葛根生津止渴，黄连清热燥湿，苍术燥湿健脾，水蛭破血通经、逐瘀消癥，合为臣药；绞股蓝益气养阴、清热解毒，山药生津益肺，丹参活血祛瘀、凉血消痈，合为佐药；冬葵果清热利尿，为使药。诸药合用，能益气健脾、养阴清热以治本，祛湿化痰、活血通络以治标，以达养阴清热、清热活血之功效。本文参考中药质量标志物确认原则，选取君药黄芪所含代表性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，臣药太子参所含主要有效成分太子参环肽B，佐药绞股蓝所含特征性成分绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ为定量测定目标成分，为全面评价通脉降糖胶囊产品质量提供参考。

3.2 流动相的选择

参考相关文献，对乙腈-水[12-14]、乙腈-0.3%甲酸溶液[11，15-16]和乙腈-0.3%冰醋酸溶液[10]3个流动相体系进行对比考察，结果表明以乙腈-0.3%甲酸溶液为流动相时，各色谱峰分离度较好，为使检测的7种成分出峰时间更合理，峰形好，杂质最少，采用梯度洗脱法对有机相乙腈和水相0.3%甲酸溶液比例进行不断调节和优化，最终确定采用乙腈-0.3%甲酸溶液为流动相，按正文2.1项下的梯度洗脱程序对通脉降糖胶囊中的7种成分进行同时检测。

3.3 通脉降糖胶囊供试品溶液制备方法的优化

首先在超声提取60 min的同一条件下，对不同提取溶剂(甲醇[10-16]、50%甲醇、乙醇、50%乙醇)进行对比考察，以通脉降糖胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的综合提取率以及杂质峰数量等为指标，结果以甲醇为提取溶剂时，所测7种成分提取效果最佳，杂质峰较少；进而依次对提取方式(超声提取[12-15]、加热回流提取[10-11，16])、提取时间(15、30、60 min)进行对比实验，最终确定采用甲醇超声提取30 min作为通脉降糖胶囊供试品溶液的制备方法。

本文首次采用HPLC梯度洗脱法，对通脉降糖胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子参环肽B、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷ⅩⅦ含量进行同时测定，建立了通脉降糖胶囊多指标质量控制模式，所建立的方法操作便捷、重复性好、准确度高、专属性强，为提升通脉降糖胶囊的质量控制标准提供了有力的数据支持。