席兴字， 王红亮， 马克学

(1. 新乡学院 教育科学系, 新乡 453003; 2. 河南师范大学 生命科学学院, 新乡 453007)

淡水涡虫属于扁形动物门涡虫纲的代表性动物，具有极强的再生能力[1]。涡虫头部被切除后，3 d能够再生出新的眼点，7 d能够再生出新的头部[2-3]。著名的遗传学大师摩尔根把它描述为 “切不死的动物(Immortal under the edge of the knife)”。此外，一条涡虫无论横切多少段，总是面向前端的伤口再生出头，面向后端的伤口再生出尾。摩尔根认为，从前到后有一种物质浓度梯度决定了涡虫前后轴的极性[4]。在地中海涡虫(Schmidteamediterranea)中研究发现，Wnt/β-catenin 信号通路对涡虫前后轴极性的重新建立具有决定作用。用RNAi(RNA interference)技术抑制β-catenin-1基因表达诱导涡虫后端再生出头部，产生双头涡虫[5-6]。但是，β-catenin-1控制了哪些信号分子导致涡虫前后轴极性的改变仍不十分清楚。为了回答这一问题，建立稳定可靠的双头涡虫模型就显得非常重要。鉴于此，作者尝试建立双头涡虫模型，为涡虫领域RNAi研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

日本三角涡虫(Dugesiajaponica)单克隆系，本实验室建立和保存。本实验所用的Taq酶，pMD19-T载体、质粒DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等分子生物学试剂购自宝生物工程有限公司。实验所用的引物和测序由苏州金唯志公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和Dj-β-catenin-1基因的克隆

取6条涡虫用液氮研磨成粉末后加入Trizol 试剂抽提总RNA，然后用RNase-free DNase I 消化模板去除基因组DNA。取2 μg 总RNA用宝生物cDNA合成试剂盒(TaKaRa PrimeScriptTMII 1st strand cDNA synthesis kit, Code No. 6210A)合成cDNA置于-20 ℃保存备用。根据日本三角涡虫β-catenin-1基因序列(GenBank MG599480)设计一对5′端带有T7启动子的特异性引物(上游……