邵梦瑶, 路福平, 朱欣娜, 张学礼

(1. 天津科技大学 生物工程学院, 天津 310018； 2. 中国科学院 天津工业生物技术研究所, 天津 300308； 3. 中国科学院 系统微生物工程重点实验室, 天津 300308)

大肠杆菌被广泛应用于发酵工程和代谢工程等诸多生物学领域[1]。为使大肠杆菌成为生产有机酸[2]和氨基酸[3-4]等重要的工程菌株，敲除及整合外源功能基因是常常用到的策略。通常的技术手段是利用Red重组酶进行同源重组实现基因的敲除和整合，但该技术方法操作繁琐。因此，研究人员对简单快速的基因编辑系统的需求越来越迫切。

2012年，Jennifer A. Doudna[5]阐明了Type II CRISPR系统中的Cas9核酸酶(来源于化脓链球菌Streptococcuspyogenes)的功能，这个160 ku的核酸酶结合两个RNA(crRNA和tracrRNA)就可以实现对双链DNA的切割。这为新的基因编辑系统奠定了最根本的基础。

2013年，张峰课题组[6]证实了CRISPR/Cas9基因编辑系统能够实现对原核微生物如链球菌和大肠杆菌的基因编辑。该研究虽然证明了CRISPR/Cas9[7]能对大肠杆菌进行基因编辑，但并没有建立起良好的可操作体系。2015年，美国伊利诺伊大学香槟分校赵惠民课题组[8]和中科院上海植生所杨晟课题组[9]分别在链球菌和在大肠杆菌中建立了完善的 CRISPR/Cas9 基因编辑系统。这两个系统都将crRNA和tracrRNA融合表达出gRNA，不同之处前者是单质粒编辑系统，后者是双质粒编辑系统。单质粒编辑系统[10]将Cas9，gRNA和供体DNA构建在同一个表达载体上，在遗传操作过程中，只需一轮质粒转化就能实现对基因组的编辑。但单质粒由于本身骨架片段较大，可插入的供体DNA大小受限，质粒构建会有一定的难度。……