孟平平，李媛媛，高蕊，张攀，王娜，黄瑾

(石河子大学医学院生化教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002)

Neuritin(CPG-15，可塑性相关候选基因15)作为神经营养因子，在神经系统发育过程中发挥作用，其能通过促进神经突起生长[1-2]、神经元突触传递[3]和调节突触可塑性[4-6]，抑制神经元的凋亡[7]。本课题组前期研究结果证实，重组Neuritin蛋白能够促进鸡胚背根神经节(DRG)和PC12细胞突起生长[8]，诱导骨髓间充质干细胞分化为类神经细胞，并促进其迁移[9]。进一步的动物实验研究证实，局部给予重组Neuritin蛋白，不仅明显促进外周神经(坐骨神经)损伤后的再生修复[10]，而且能够促进中枢神经(脊髓)损伤的功能恢复[11]。因而，研制、开发neuritin基因工程类药物具有广阔的临床应用前景。

本课题组前期已获得具有活性的重组Neuritin蛋白[12]，由于纯化需要，以上重组Neuritin蛋白均带有His标签，不符合重组蛋白药物的标准，因此寻找合适的方法去除重组蛋白中的标签，至关重要。

本研究旨在利用基因工程技术构建带有酶切位点的neuritin重组大肠杆菌pET32a-neuritin表达系统，并筛选出高表达的菌株；为后期酶切去除His标签，获得无标签的重组 Neuritin 蛋白奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒

大肠杆菌 DH5α：分子克隆的受体菌，购自 Invitrogen 公司；大肠杆菌 BL21 (DE3)：分子克隆的表达菌，新疆农垦科学院畜牧所甘尚权老师惠赠；pET32a质粒：分子克隆载体，新疆农垦科学院畜牧所甘尚权老师惠赠；pcDNA3.1-neuritin质粒：由本室保存。

1.1.2 仪器与试剂

电泳仪、电转膜仪均购自 BIO- RAD 公司；限制性内切酶 NcoI、XholI、TaqDNA 聚合酶、T4连接酶购自Promega公司；质粒提取试剂盒、DNA Ladder购自天根公司；胶回收试剂盒、IPTG购自TakaRa 公司；酵母提取物和胰蛋白胨购自 Oxide 公司；PVDF膜购自Solarbio公司；Neuritin 多克隆抗体为本实验室制备，山羊抗鼠 IgG- HRP 购自中衫金桥公司；化学发光试剂盒购置 Millipore 公司；蛋白分子量 Marker 购自 Thermo 公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据 NCBI 数据库中序列号为 NM_016588.2 的neuritinORF(无信号肽、无 GPI)序列设计特异性引物。在pET32a载体自身His标签和肠激酶序列之后克隆插入neuritin基因,限制性内切酶分别为 NcoI、XholI。以本实验室保存质粒pcDNA3.1-neuritin为模板，PCR扩增neuritin基因。上游引物:CATGCCATGGCTGACGACGAC GACAAGGCGGGCAAGTGCGATGCGGTC；下游引物:CACCTCGAGTTCAGTTGCCGCTGCCGCAGAG。循环参数为：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s、65 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 45 s 进行 35 个循环，72 ℃延伸 10 min。待反应完毕后，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达

第一天晚上随机挑取阳性转化子摇菌，无菌牙签接种至 5 mL 含有 100 μg·mL-1氨苄青霉素的 LB试管中，放置摇床，260 r·min-1，37 ℃培养过夜。次日早上按 1∶100 比例扩大培养，转至 20 mL 培养基。37 ℃，260 r·min-1，培养约3 h，使其 OD 值大于 0.6(未诱导取 2 mL 作对照)。加入诱导剂 IPTG 使其终浓度为0.1 mmol·L-1，37 ℃诱导8 h。收菌后4 ℃，12 000 r·min-1离心 10 min，弃尽上清，用 50 μL 10 mmol·L-1PBS 重悬菌体，再加入等体积的 2× loading buffer，100 ℃煮沸 7 min；待其降至室温后，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min，收集菌体，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定Neuritin蛋白。

1.2.3 高表达菌株的筛选

挑选50个阳性转化子，IPTG诱导8 h，收菌后超声破菌，收集上清，SDS-PAGE鉴定蛋白表达量，通过 ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度扫描，筛选出高表达的菌株，并保菌。

1.2.4 Neuritin 蛋白的 SDS-PAGE及Western Blot鉴定

收集菌体上清，加入上样缓冲液，煮沸8 min，进行SDS-PAGE(15%)电泳。电泳结束后考马斯亮蓝染色、脱色后，ImageLab 拍照，并运用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度扫描。Western blot检测蛋白，SDS-PAGE电泳结束后，采用蛋白半干转膜仪将蛋白从凝胶转移至PVDF膜上。封闭2 h后进行抗体孵育，一抗为Neuritin抗体(实验室制备)1∶500比例稀释，室温孵育 2 h，用 1×TBST 洗膜，5 min×1次，15 min×3次。二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，1∶5000 比例稀释，室温孵育 2 h，用 1×TBST洗膜，5 min×1 次，15 min×3 次。用 ECL 发光试剂盒检测蛋白印迹条带，并曝光显影。

2 结果

2.1 pET32a-neuritin重组质粒构建策略

在pET32a载体自身His标签和肠激酶序列之后克隆插入neuritin基因,限制性内切酶分别为 NcoI、XholI。

2.2 目的基因neuritin的PCR产物鉴定

PCR扩增neuritin产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在约300 bp处出现特异性条带。与预期结果一致(图2)。

2.3 pET32a-neuritin重组质粒菌落PCR鉴定

将neuritin的PCR产物和pET32a质粒的酶切产物进行连接并转化DH5α感受态后，对阳性转化子进行PCR鉴定。结果显示在 300 bp 处出现特异性条带(图3)。

M：DNA Marker；Lane1-10：含重组质粒的阳性转化子。图3 重组质粒pET32a-neuritin菌落PCR鉴定

2.4 pET32a-neuritin重组质粒双酶切鉴定

将菌落PCR鉴定阳性的转化子提取质粒，并用NcoI、XholI 酶切重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测可见约300 bp片段和5 000 bp片段，与预期结果一致(图4)。结果表明neuritin基因已成功插入到pET32a载体中。

M：DNA Marker；Lane1：pET32a-neuritin；Lane2-3： NcoI/XholI双酶切pET32a-neuritin。图4 重组质粒pET32a-neuritin双酶切鉴定

2.5 重组质粒pET32a-neuritin测序鉴定

将菌落PCR和双酶切鉴定阳性的重组质粒，转化至 BL21 感受态中，挑取阳性转化子摇菌后，送北京华大公司测序鉴定，测序结果显示插入的目的基因片段264 bp，与 GeneBank 中人源neuritin序列完全一致(图5)，表明重组质粒构建成功。

图5 重组质粒pET32a-neuritin测序结果

2.6 重组Neuritin蛋白的诱导表达及鉴定

阳性转化子经IPTG 诱导表达蛋白后，SDS-PAGE 鉴定显示，重组质粒 pET32a-neuritin在 25kDa左右出现目的条带(图6A)，与理论值相符。Western blot 鉴定结果显示在 25kDa左右出现目的条带(图6B)，证明诱导表达获得的蛋白为 Neuritin 重组蛋白。

A：M：Protein Marker；Lane1-3：pET32a未诱导、 诱导、诱导；Lane4-6：pET32a-neuritin未诱导、诱导、诱导 B：Lane1-2：pET32a未诱导、诱导； Lane3-4：pET32a-neuritin 未诱导、诱导。图6 重组质粒pET32a-neuritin的诱导表达鉴定

2.7 高表达菌株的筛选

将测序正确的pET32a-neuritin重组质粒转化至 BL21 感受态后。共挑取 50 个阳性转化子用IPTG 诱导 8 h，收菌后利用超声破菌，收集上清，SDS-PAGE鉴定蛋白表达量(图7A)。经对蛋白表达条带的灰度值扫描(图7B)，6号 lane 的总灰度值最大，即目的蛋白表达量最高，从而筛选出高表达菌株为 6号 Lane 对应的 6号单克隆。

A：M：Protein Marker；Lane1-7:不同单克隆的蛋白表达量； B：1-7:不同单克隆的蛋白表达量灰度值扫描结果。图7 SDS-PAGE鉴定高表达菌株

3 讨论

本研究旨在获得带有肠激酶序列的高表达的原核表达系统 pET32a-neuritin，为后期酶切去除重组蛋白His标签奠定基础，同时，本研究考虑到后期蛋白纯化的高效和便捷，在neuritin的5’端引入pET32a 载体自身His标签。其次，利用肠激酶可特异性识别并水解多肽序列的特点，在neuritin与His之间引入pET32a载体自身的肠激酶序列，便于后期切除His标签。

重组蛋白的生产对于生物技术和生物医学至关重要。为了利于研究，这些蛋白质通常需要大量表达和纯化。重组蛋白的纯化通常使用的标签包括多组氨酸(His)，谷胱甘肽S -转移酶，麦芽糖结合蛋白和硫氧还蛋白[13]。其中，His标签在纯化重组蛋白中是应用最广泛的方法[14]。本研究在neuritin的5’端引入pET32a 载体自身His标签，目的是利用His 与 Ni 2+ 间的配位亲和作用,使得后期重组蛋白得到有效纯化[15]，初步获得高纯度重组蛋白。由于His标签仅含有6个氨基酸，研究者们认为其不会显著干扰大多数蛋白质的功能和结构[16-17]。然而越来越多的研究表明His可能会影响蛋白的结构和功能。Mohanty等人的研究证明了改变His标签的长度和位置对膜蛋白的表达产生影响[18]。His标签可能影响蛋白质的低聚状态和功能[19]。此外，添加His标签可以改变蛋白质动力学，可能影响蛋白质活性或功能[20]。因此，本研究在利用His标签提高重组蛋白的纯化效率后，引入肠激酶将该标签去除。

肠激酶是由小肠粘膜上皮细胞所分泌出的一种丝氨酸蛋白酶，其主要功能是激活胰蛋白酶原，使之成为有活性的胰蛋白酶，从而引起下游的蛋白酶级联反应[21]。由于肠激酶的轻链具有非常独特的底物选择能力，它可特异性识别并水解多肽序列DDDDK (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 的羧基端肽键，不会在 DDDDK 序列下游蛋白 N-端留下多余氨基酸残基，从而获得无标签的重组蛋白。因此，肠激酶也成为酶切含有标签的重组蛋白的首选生物工具酶[22]。同时，该酶能在较宽的pH范围(4.5～9.5)、较宽的温度范围(4 ℃～45 ℃)及在多种变性剂和去污剂存在的条件下保持活性[23]，因此肠激酶是一种理想的用于处理融合蛋白的工具酶，广泛的应用于生物技术领域[24]。

综上所述，本研究成功构建了带有肠激酶序列的原核表达系统 pET32a-neuritin，并筛选出高表达Neuritin蛋白的菌株。为后期获得无标签的重组Neuritin 蛋白奠定基础。