赵 位，邓 晴，喻 东，杨晓军，杨 森，蒋 海，唐 浩，张清宇，张晓敏，龙 梅，罗 燕

(1.四川农业大学 动物医学院，成都 611130；2.四川卧龙国家级自然保护区管理局，四川汶川 623006)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是定植于人和动物肠道、呼吸道内的重要条件性致病菌，在自然界中广泛存在，自Escherich于1885年首次分离到该菌以来，在人、家禽、家畜及野生动物机体中也分离到了该菌[1-2]。大量研究表明，大肠杆菌致病菌株能够对人和动物产生致病，常引起严重败血症、腹泻以及水肿等多种临床症状[3]。其中，产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起婴儿和幼畜腹泻的一种重要病原菌。在畜牧养殖中，ETEC常引起仔猪、牦牛、犊牛、羔羊、鸡等多种动物腹泻，初生幼畜常常因ETEC引起的剧烈水样腹泻和脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，给养殖业带来严重的经济损失[4]。研究发现，ETEC首先通过黏附性菌毛对宿主的肠上皮细胞进行黏附，然后大量增值并产生不耐热肠毒素(Heat labile enterotoxin，LT)或耐热肠毒素(Heat stable enterotoxin，ST)，进而发挥致病作用[4]。

在多种ETEC宿主中，仔猪尤为易感。在家猪研究中，Verdonck等[5]于2002年就对比利时断奶仔猪感染ETEC进行报道，并对F4型ETEC和F18型产Vero毒素大肠埃希氏菌(Verocytotoxin-productionEscherichiacoli,VTEC)引起机体的免疫反应进行比较，结果证实，F4型ETEC能够更早地引起猪机体产生IgA、IgM和IgG。Do等[6]也报道越南北部ETEC引起大量断奶仔猪腹泻。在国内，周双德等[7]对猪ETEC进行报道，并针对猪ETEC常见毒素LTⅠ、STa和VT2e建立了多重PCR检测方法。谢俊伟等[8]对河南某猪场患腹泻2月龄仔猪进行病原研究证实，该猪场腹泻是由猪瘟与ETEC的混合感染引起。而在野猪的相关研究中，有关于产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli)、肠致肠病性大肠杆菌(EnteropathogenicEscherichiacoli)、肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli)的报道[9-10]。目前，国内外鲜见ETEC在野生野猪上的报道。本研究从四川省卧龙自然保护区野猪粪便中分离出1株大肠杆菌，对其进行生化和16S rRNA基因分子鉴定，并通过药敏试验、特异性毒力基因和耐药基因扩增，以期对其分类及耐药性进行分析，为ETEC在野猪上引起腹泻的防控和治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Luria-Bertani(LB)培养基、麦康凯培养基、Mueller-Hinton(MH)培养基以及药敏纸片等均购自杭州微生物试剂有限公司；2×TaqPCR MasterMix Kit、粪便基因组DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化试剂(北京)有限公司；PCR反应的引物合成以及产物测序，均由杭州有康生物科技有限公司完成；家猪血液样品为四川农业大学动物检疫实验室 保存。

1.2 野猪粪便样品采集及分子鉴定

采集四川省卧龙自然保护区7份野猪粪便，保存于4 ℃冻存盒中，并立即送往实验室，然后采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便总DNA，并参照文献引物(表1)，对总DNAcytb基因及致泻性大肠杆菌特异性基因Stx1、Stx2、LT、ST Ⅰ、STⅡ、EaeA和ial进行PCR扩增。同时，设置家猪血液DNAcytb基因对照[11]。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后送至有康生物科技有限公司进行测序，并将测序结果进行在线比对。

1.3 菌株分离

将致泻性大肠杆菌特异性基因扩增阳性的野猪粪便样品进行梯度稀释后涂布于麦康凯培养基平板上，每个梯度做3个重复，麦康凯培养基平板置于37 ℃恒温培养箱，培养24 h后挑选单菌落进行划线纯化，然后进行革兰染色，确定为纯培养物后，以甘油保存于-70 ℃冰箱，备用。

1.4 菌株生化鉴定

将菌种划线接种于LB琼脂培养基，培养 16 h后观察菌落颜色、形态，并采用细菌微量生化反应管依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行生化鉴定，操作步骤按照细菌微量生化反应管说明书 进行。

1.5 菌株16S rRNA基因扩增

将纯化好的菌种接种于LB培养基，37 ℃培养16 h，利用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，作为PCR反应模板，应用通用引物(表1)对16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR反应体系参照文献[12]进行，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后送至有康生物科技有限公司进行测序，并将测序结果进行在线比对。

1.6 菌株毒力基因和耐药基因的扩增

利用提取的菌株DNA为模板，参照SN/T 3640-2013设计引物，对该菌株可能携带的Stx1、Stx2、LT、STⅠ、STⅡ、EaeA、ial等毒力基因进行PCR扩增。同时，对其可能携带的耐药基因mecA、blaOXA、blaIMP、blaDHA、ant(4′,4′)、tetA、tetB、sulⅠ、sulⅡ、aph(3′)-Ⅱa、aac(3′)-Ⅱa、carO、KPC-2和blaNDM等进行PCR扩增，特异性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至有康生物科技有限公司进行测序，测序结果进行在线比对，引物相关信息见表1。

1.7 药敏试验

将纯培养的菌液经活菌计数，调整活菌数为 2.4×108CFU/mL，无菌棉签均匀涂布于MH培养基，待稍干后用无菌镊子将20种药敏纸片分别贴在培养基表面，然后置37 ℃恒温培养16～ 18 h，游标卡尺测定抑菌圈直径。药敏结果参照CLSI进行判定。

2 结果与分析

2.1 粪便总DNA分子鉴定

以提取的7份野猪粪便总DNA和家猪血液总DNA为模板，分别进行cytb基因扩增。结果显示(图1)，采集的7份野猪粪便总DNA和家猪cytb基因PCR扩增产物大小均为635 bp，与预期结果一致。将目的条带胶回收后测序，比对结果显示二者相似性为99.98%。在线比对分析表明，粪便cytb基因扩增产物与数据库收录的猪cytb基因相似性最高。cytb基因PCR扩增证实，采集的7份粪便均为野猪粪便。对7份野猪粪便总DNA进行致泻性大肠杆菌特异性基因扩增结果显示，7份粪便样品总DNA中Stx1、Stx2、LT、ST Ⅰ、EaeA和ial基因扩增均为阴性，而1份粪便样品ST Ⅱ基因为阳性，其扩增产物大小约为421 bp (图2)，与数据库中收录的大肠杆菌STⅡ基因(KY581591.1)相似性为98.64%。

2.2 细菌的分离培养

对1份STⅡ基因阳性野猪粪便进行培养 16 h后，在麦康凯培养基，形成大量红色、边缘光滑、湿润的菌落，在LB平板上面可见乳白色、圆形、表面光滑、直径约2 mm的菌落。革兰染色可见红染的直杆菌，菌落形态及革兰染色结果见图3。

2.3 菌株的生化性质

各项生化指标检测试验发现，分离菌株发酵葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、麦芽糖、棉籽糖、木糖均产酸产气；鸟苷酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶呈阳性；苯丙氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、氧化酶、尿素酶、山梨醇和侧金盏花醇呈阴性；不产H2S，VP试验为阴性(表2)。以上结果符合大肠杆菌的生化 特征。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Information of primers in this study

M.DL2000 plus DNA marker；1.家猪血液DNA cyt b基因扩增；2～8.7份野猪粪便DNA cyt b基因扩增

M. DL2000 DNA marker；1～7.7份野猪粪便DNA STⅡ基因扩增

图3 分离菌株的在LB上菌落形态(A)、麦康凯上的菌落形态(B)与革兰染色结果(C)Fig.3 Colony morphology of isolate on LB plate(A) and Maconkey agar plate(B) and Gram staining results(C)

表2 分离菌株生化鉴定结果Table 2 Results of biochemical identification of isolated strains

2.4 菌株16S rRNA基因序列分析

分离菌株16S rRNA基因PCR扩增产物大小约为1 400 bp，琼脂糖凝胶电泳结果见图4。将目的条带胶回收后测序，结果表明该菌 16S rRNA基因大小为1 397 bp。将序列提交至GenBank数据库(登录号：MN368163)，并在 NCBI上对该序列进行Blast比对分析，结果显示，该分离菌的16S rRNA基因序列与大肠杆菌LD91-1菌株(登录号：CP042585.1)的16S rRNA基因序列覆盖度和相似性均为100%。因此结合生化试验和16S rRNA基因分析，确定该菌种为大肠杆菌。

2.5 菌株毒力基因和耐药基因的扩增

对分离菌株部分毒力基因和耐药基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示(图5)，该分离菌株基因组中携带耐热肠毒素基因STⅡ。而耐药基因扩增表明，该分离菌株基因组中mecA、blaOXA、blaIMP、ant(4′,4′)、tetA、tetB、aph(3′)-Ⅱa、carO和KPC-2扩增为阳性，电泳条带与预期大小相符(图6)。毒力基因和耐药基因扩增产物测序结果在线比对证实，其与GenBank数据库中相应的毒力基因和耐药基因序列一致。

M.DL2000 plus DNA marker；1.16S rRNA；2.空白对照

M.DL2000 DNA marker；1. STⅠ；2. STⅡ；3.LT； 4. Stx1；5. Stx2；6.EaeA；7.ial

M.DL2000 DNA marker；1.mecA；2.tetA；3.tetB；4. aac(3′)-Ⅱa；5. sulⅠ；6. sulⅡ；7. aph(3′)-Ⅱa；8.blaDHA；9.blaIMP； 10. ant(4′,4′)；11.blaOXA；12.blaNDM；13.carO；14. KPC-2

2.6 药敏试验

参照CLSI药敏纸片扩散法对菌株进行药物敏感性试验，结果参照CLSI进行判定。表3显示，分离菌株对红霉素、四环素、头孢拉定、头孢他啶、奥格门丁、林可霉素、氨苄西林和氨曲南8种药物具有抗性，对阿米卡星、头孢唑啉、头孢曲松、链霉素、氧氟沙星、庆大霉素、诺氟沙星、氯霉素、复方新诺明和亚胺培南10种药物敏感，而阿奇霉素和多粘菌素药敏结果为中介。

3 讨 论

在自然界中，大肠杆菌广泛存在于人和动物肠道、呼吸道以及土壤、水、农产品中，也是一类重要的人畜共患病原菌，当人或动物机体抵抗力下降或当携带某些毒力因子的大肠杆菌侵入肠道和呼吸道外组织或其他器官时，就会引起感染[16]。可引起腹泻的大肠杆菌被称为致泻性大肠杆菌，其往往携带某些重要的毒力因子[17]。临床上，致泻性大肠杆菌的准确鉴定，对腹泻病的防治尤为重要，传统上往往采用血清型鉴定对致泻性大肠杆菌与正常大肠杆菌进行区分，而大量报道表明，血清型鉴定存在可重复性低、工作量大、成本高等特点[18-20]。研究表明，致腹泻的5类大肠杆菌中，除了弥散粘附性大肠杆菌，其余4种致泻性大肠杆菌均具有特定的毒力因子[21]。因此，通过不同致泻性大肠杆菌特定毒力因子的PCR扩增检测，能够快速、准确地对其进行区分。本研究通过PCR扩增致泻性大肠杆菌特定毒力因子，发现一株分离于野猪粪便的大肠杆菌携带有耐热肠毒素STⅡ基因，证实该分离株属于致泻性大肠杆菌中的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)。ETEC可同时携带耐热肠毒素和不耐热肠毒素，也可仅携带耐热肠毒素或不耐热肠毒素，在新生儿和幼畜腹泻中检出率极高，常引起的剧烈水样腹泻和脱水[3]。目前，尚未有野生野猪上分离ETEC的报道。通过粪便形态特征和cytb基因序列分析，证实采集的粪便为野猪粪便。而从野猪粪便的状态、颜色、形状上看，并没有出现腹泻症状，这可能与宿主机体状况以及粪便中ETEC的数量存在关系。

表3 分离菌株药敏试验结果Table 3 Results of drug sensitivity of isolated strains

临床上，抗生素是进行大肠杆菌病治疗的的首选方法。但是随着抗生素的不合理使用，导致了大肠杆菌耐药性和耐药谱增加，从而增加了临床大肠杆菌疾病治疗的困难。本研究对四川省卧龙自然保护区野猪粪便中分离出的一株大肠杆菌耐药情况分析发现，14种耐药基因中，四环素类耐药基因tetA和tetB、大环内酯类耐药基因mecA、β-内酰胺类耐药基因blaOXA、blaIMP、carO和KPC-2以及氨基糖苷类耐药基因aph(3′)-Ⅱa和ant(4′,4′)均为阳性。而药敏试验表明，该分离株为多重耐药菌株，其对红霉素、多种β-内酰胺类、四环素类等药物具有抗性，不过仍然对β-内酰胺类的头孢唑啉、头孢曲松、亚胺培南等药物敏感。亚胺培南作为碳青霉烯类常见抗生素，是目前临床治疗多重耐药性革兰阴性菌感染的重要抗生素[22]，而碳青霉烯水解酶的出现，使很多菌株对碳青霉烯类抗生素产生抗性，其中KPC型碳青霉烯酶作为β-内酰胺酶的重要成员被广泛关注[23]，此外，carO基因编码膜孔蛋白，也能够影响菌株对β-内酰胺类药物的敏感性[24]。本研究中，虽然分离菌株均携带KPC-2和carO基因，但是药敏结果显示，菌株对亚胺培南仍敏感，可见耐药基因型与表型之间存在差异，这可能存在耐药基因未表达或发生突变等情况，其具体原因还需要进一步研究探讨。

野生动物生活方式特殊，发病较少，人为影响也较少，其受抗生素的影响的可能性也较低。然而，随着抗生素的大量使用及人为对野生动物活动区域的影响，越来越多的野生动物源致病菌均表现出耐药性。本研究首次对卧龙自然保护区野生野猪源多重耐药产肠毒素大肠杆菌进行报道。在其他野生动物上也有耐药性大肠杆菌的报道，在四川地区圈养长颈鹿、蜂猴、金丝猴、黄虎等多种野生动物源大肠杆菌的耐药性分析发现，圈养野生动物源大肠杆菌对多种磺胺类药物都表现出耐药[25]。Pavlickova等[26]对分离自家鸡和野鸡、野鸭的105株大肠杆菌耐药基因进行比较发现，野鸡和野鸭源大肠杆菌主要携带CEF、CXM、CTX等头孢类药物耐药基因。此外，在黑鸢、海鸥、狼和狐狸等多种野生动物上均发现多重耐药大肠杆菌[27]。可见，野生动物源大肠杆菌耐药性已经比较普遍，这对于养殖业的发展和人类的健康存在重大隐患，值得引起关注和重视。

综上所述，本研究通过对野生野猪源大肠杆菌的分离鉴定、药敏试验、致病类型、耐药基因进行系统研究，在野生野猪粪便中分离出1株多重耐药产肠毒素大肠杆菌，为野猪源病原菌的致病性及耐药性研究奠定基础。