刘得水 周建文 程昊 赵诗瑶 李洋 张英华 徐广有

摘  要：目的  本研究探讨氯喹对肝癌细胞在低氧环境下的增殖和侵袭的影响及其潜在的作用机制。方法  取肝癌细胞HepG2细胞分成空白对照组，阴性对照组，和氯喹干预组，采用qPCR检测氯喹在肝癌细胞HepG2以及正常肝组织上皮细胞SMMC-7721中氯喹的表达水平。用氯喹处理HepG2细胞;通过MTS微量酶反应比色法、流式细胞术、western blot，葡萄糖和乳酸检测分析试剂盒，检测给予氯喹刺激后对HepG2的增殖、侵袭的影响、以及其对Wntβ-catenin通路表达的影响。结果  与空白对照组相比，氯喹组的HepG2迁移能力显著降低（P<0.05），氯喹组总凋亡率为35.5%，对照组总凋亡率为13.4%，氯喹组总凋亡率显著升高（P<0.05）。氯喹组OD 520值为（8.51±0.45），对照组为（2.97±0.33），氯喹组细胞侵袭能力降低（P<0.05）。Wntβ-catenin通路的相关蛋白表达降低。结论  氯喹可通过调控Wntβ-catenin通路表达，调控HepG2细胞增殖，凋亡及侵袭能力。

关键词：肝癌;氯喹;增殖;Wntβ-catenin通路

中图分类号：R735.7    文献标识码：A    文章编号：1009-8011（2020）-11-0039-03

肝癌是我国发病率非常高的分泌系统恶性肿瘤，易复发，5年生存率极低。目前迫切需要找到新的分子靶点和治疗策略来遏制肝癌发展恶化[1-3]。氯喹是一种抗疟原虫药，其作用机制在于本品与核蛋白有较强的结合力，插入到DNA的双螺旋两股之间，可与DNA形成复合物，从而阻止DNA的复制与RNA的转录[4-5]。目前肿瘤细胞代谢方面的研究已成为当今肿瘤研究的热点。本研究将通过分子实验预测氯喹对肝癌细胞增殖与分化以及糖代谢的影响，为临床诊治提供新靶标。

1  材料与方法

1.1  细胞培养

肝癌HepG2（ATCC○ CRL-1420TM）细胞购自中国科学院细胞库，正常肝组织上皮细胞SMMC-7721（由广州烨善生物科技有限公司提供）用10%FBS（Hyclone，USA）、DMEM（Gibco Corporation，USA）培养于37℃、5%C02潮湿大气细胞培养箱中。将实验分为三组：空白对照组，阴性对照组，氯喹干预组。

1.2  氯喹浓度及给药方式

从湖北邦盛化工有限公司购入氯喹100g。按照说明书以5mg/mL剂量将氯喹加入HepG2细胞氯喹干预组中。

1.3  Western blot法检测蛋白表达

利用细胞裂解液将蛋白从细胞中提出，12000rpm离心15min，用双氰胺酸（BCA）法测定蛋白浓度，使用含有聚丙烯酰胺凝胶的SDS电泳分离蛋白质样品，将分离的蛋白质样品转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白在TBST缓冲液中阻断2h后，用抗体在4℃孵育过夜。用TBST缓冲液冲洗3次10min，用相应的HRP标记的二级抗体在室温下孵育2h，再用TBST缓冲液冲洗3次。用化学发光HRP底物增强化学发光检测系统对印迹信号进行可视化。检测beclin-l，LCI，LC-llc-myc，cyclin D1 klotho，β-tublin，lamin BI表达。

1.4  MTS法检测细胞增殖

将细胞接种到96孔板中，浓度为1×103个细胞/孔，贴壁过夜。每24h，20μL溶液试剂添加到每孔中，使用酶联免疫吸附测定仪（BioTek，VT，美国）在37℃孵育3h后，酶标仪读板，MTS检测读取OD490数据根据以下公式计算存活率：存活率=[（实验组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）]×100%。

1.5  流式检测细胞凋亡

将细胞培养板各组的培养基分别转移到15mL的锥形管中并置于冰上。利用胰蛋白酶将细胞消化下来、PBS洗涤后48h收集细胞，用Annexin V凋亡检测试剂盒FITC（E.BioSoCion，圣地亚哥，CA92121美国）在室温下用V-FITC和碘化丙啶染色。用流式细胞仪（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）进行细胞凋亡分析。

1.6  Transwell检测细胞侵袭能力

用胰蛋白酶/EDTA法检测HEPG2细胞的迁移和侵袭。将所有细胞（1.5×105）置于transwell chambers（Corning Incorporated，USA）中进行迁移测定，并将1×104细胞置于涂有150mg基质凝胶的上腔室中进行侵袭测定。下腔注入含10%FBS的DMEM。在37℃下孵育12～24h后，移走细胞膜上表面的細胞。膜下表面的细胞被水晶紫固定和染色。在光镜下观察和计数染色细胞。

1.7  统计学处理

所有实验均至少重复3次，实验数据用（x±s）表示，采用SPSS22.0软件进行数据分析。3组蛋白表达水平，细胞存活率，相关蛋白表达水平的比较用单因素方差分析，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2  结果

2.1  MTS检测细胞活力

在给予氯喹后，使用MTS法对不同时间点（0h、24h、48h和72h）的肝癌HepG2细胞活力进行检测。与对照组相比，氯喹组在48h和72h能够显著性抑制细胞活力（t=4.454，P<0.05）并且细胞增殖明显降低（t=7.823，P<0.05）。见图1。

2.2  给予氯喹对HepG2细胞凋亡率的影响

流式细胞仪分析结果显示，给予氯喹后HepG2细胞凋亡明显，氯喹组总凋亡率为35.5%，而对照组总凋亡率为13.4%，氯喹组总凋亡率显著升高（χ2=22.353，P<0.05）氯喹组早期凋亡，晚期凋亡和总凋亡细胞数都较对照组显著增加（P<0.05）。见图2A-G。

Transwell检测结果显示，与空白对照组相比，氯喹组OD 520值为（8.51±0.45），对照组为（2.97±0.33），氯喹组细胞侵袭能力降低（P<0.05）。氯喹组可抑制HepG2细胞的侵袭能力，差异具有统计学意义（P<0.01）。见图3A-B。

2.4  HepG2 细胞中Wntβ-catenin通路中相关蛋白表达情况

与对照组相比，氯喹组Koho，B-catenin，表达上升，C-myc和Cyclin DI I的蛋白表达明显下降，说明氯喹组的Wntβ-catenin被明显抑制。见图4。

3  讨论

对于大多数肿瘤细胞来说，癌基因的突变起到十分关键的促进作用[6]。恶性肿瘤的发生与蛋白质靶点的突变和异常相关，氯喹可作为放化疗增敏剂提高抗癌疗效，抑制细胞生长、分化并诱导细胞凋亡，特别是其能够抑制自噬的功能在肿瘤治疗中具有重要作用。因为自噬在肿瘤生长过程中的角色会随着疾病的病程变化而不断产生动态变化，与肿瘤的发展密切相关，因此氯喹的自噬抑制作用有望为肿瘤治疗提供一种新方法。

本研究中，氯喹可以明显降低低氧环境下抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力。表明氯喹对肝癌细胞系具有一定的抗肿瘤活性。有研究报道[6]，自然产生的氯喹是一种Taq DNA聚合酶抑制剂，并可以在体外抑制肝癌的进展，这从侧面印证本研究结果[7]。本研究表明，氯喹组总凋亡率为35.5%，而对照组总凋亡率为13.4%，氯喹组总凋亡率显著升高，结合功能实验证实，氯喹的表达可以明显抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力，机制通路实验表明，氯喹很可能是通过调节有关Wntβ-catenin通路的相关来调控肝癌细胞的增殖和侵袭能力。此外，有研究表明，氯喹诱导的肿瘤细胞死亡依赖于p53，抑制p53通路可使肿瘤细胞增值率降低百分之46.65%。然而，本研究发现，氯喹也能够诱导Wntβ-catenin表达缺失，导致肝癌细胞的凋亡，初步提示氯喹诱导的肝癌细胞死亡可能与p53的作用无关，但仍需进一步证明[8]。

综上所述，本研究通过功能实验证实，氯喹可以抑制肝癌细胞的增殖。揭示氯喹有可能成为肝癌治疗的有效靶点，但更具体的分子机制和靶向肝癌治疗效果，有待今后进一步深入的分子通路和动物实验来证实。

参考文献

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