刘晓慧 王银月 王仕婷 郑晓庆 田嘉铭 王金 赵永明，2

1 河北北方学院药学系，张家口，075000，中国

2 河北省神经药理学重点实验室，张家口，075000，中国

枳壳为芸香科植物酸橙及其栽培变种黄皮酸橙、塘橙、朱栾等的干燥未成熟果实。气味清香，味苦微酸，性微寒，归脾、胃经［1］。枳壳中含有黄酮类、生物碱类、挥发油类、香豆素类以及微量元素等活性成分，具有调节胃肠运动、抗炎抗真菌、抗肿瘤以及调节心血管系统的作用等［2-3］。

响应面法（response surface method，RSM）通过更加合理的试验设计，能以较少的试验次数完成工艺优化；采用非线性数学模型拟合回归方程，具有预测能力强等优点，因此常被用于众多生产过程、提取过程等的优化控制［4-5］。本实验采用超声辅助提取枳壳中总黄酮，选定乙醇浓度、超声提取时间和料液比3 个因素，采用Box-Behnken 设计进行实验，通过Design Expert 8.0软件进行响应面分析进而得出最优提取工艺。

1 仪器与试剂

UV-1000 型紫外分光光度计，JP-100 型超声波清洗机。芦丁对照品购于中国食品药品研究检定院，批号100080-201811，含量92.4%，供含量测定用；枳壳购自于当地药店；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品6.2 mg，无水乙醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，配成浓度为0.62 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

称取约2.5 g 枳壳粉末，精密称定，加入100 mL 体积分数为20%的乙醇溶液，超声提取30 min，冷却后补足减失的质量，滤过，续滤液即为供试品溶液。

2.1.3 标准曲线的制备

精密吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mL 对照品溶液，分别置于25 mL 量瓶中，加蒸馏水至10 mL，依次加入5%亚硝酸钠溶液1 mL、10%硝酸铝溶液1 mL 和4%氢氧化钠溶液10 mL，间隔时间均为5 min；最后加蒸馏水定容，于510 nm 处测定吸光度（A），以吸光度为纵坐标，芦丁溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.011 7X-0.002（r=0.999 3），结果表明芦丁在9.92～37.2 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度实验

精密吸取1 mL 对照品溶液，置于25 mL 量瓶中，按“2.1.3”项下方法显色，于510 nm 处连续测定6 次吸光度值，结果吸光度值的RSD 为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性实验

取按“2.1.3”项下方法显色处理的供试品溶液，分别于0、10、20、30、40、50 min 测定吸光度值，结果RSD值为0.44%，说明样品在50 min 内稳定。

2.2 单因素实验

2.2.1 提取溶媒的考察

准确称量6 份枳壳粉末，分别加入30 倍量的蒸馏水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，超声提取30 min 后依“2.1.3”项处理。结果总黄酮浸出量 分 别 为18.07、18.59、15.56、14.91、10.73、8.974 mg·g-1，表明当乙醇浓度大于20%时，枳壳总黄酮浸出量逐渐下降，因此选择20%乙醇为提取溶媒。

2.2.2 提取时间的考察

准确称量5 份枳壳粉末，分别加入30 倍量的20%乙醇，分别超声提取10、20、30、40、50 min 后依“2.1.3”项处理。结果总黄酮浸出量分别为5.08、11.37、16.79、10.05、8.38 mg·g-1，枳壳总黄酮浸出量随超声时间延长显著增大，在30 min 时出现了峰值，然后下降，因此选择超声提取时间为30 min。

2.2.3 料液比的考察

准确称取枳壳粉末，分别加入10、20、30、40、50 倍量（mL·g-1）的20% 乙醇溶液，超声提取30 min 后依“2.1.3”项处理。结果枳壳总黄酮浸出量分别为14.85、17.05、21.22、22.74 和20.09 mg·g-1，表明枳壳总黄酮浸出量随料液比增大呈上升趋势，当料液比为1∶40 时达到最高，此后略有下降，因此选择料液比1∶40 进行提取。

2.3 Box-Behnken 设计及模型拟合

以单因素实验结果为基础，影响枳壳总黄酮提取工艺的因素主要有乙醇浓度（X1）、提取时间（X2）、料液比（X3）。以这3 个因素为主要影响因素，各因素设置3个水平进行Box-Behnken 设计，因素水平表、实验安排及结果分别见Tab.1 和Tab.2。

Tab.1 Factors and level codes of Box-Behnken test

Tab.2 Experimental design and results

continued

利用Design-Expert 8.0 软件对实验数据进行回归分析，得到回归方程为：

方差分析结果表明该回归模型P＜0.05，即方程模型显著。失拟项P=0.85＞0.05，不显著，说明各实验点均能用模型描述，实验方法准确可靠。回归方程的总决定系数R2=0.896 8，调整决定系数AdjR2=0.827，变异系数CV=3.48%，表明该模型拟合度良好，实验误差小。因此该回归模型成立，可用于超声辅助提取枳壳总黄酮的分析及预测。影响总黄酮得率的因素依次为：料液比＞乙醇浓度＞超声时间。模型中料液比（X3）对总黄酮得率的线性效应显著对枳壳总黄酮得率的曲面效应显著，结果见Tab.3。

Tab.3 ANOVA results of regression model

根据拟合得到的二次多项式方程，绘制枳壳总黄酮提取率三维响应面图及等高线分析图（Fig.1），从三维图可以看出，在各因素所选范围内响应面有最高点，即总黄酮提取率存在极大值；等高线形状则反映出因素间交互作用的大小，圆形表明交互作用不显著。对所得回归方程求一阶导数，以总黄酮得率（响应值）为极大值时求得各因素的水平，得到最优提取条件为：乙醇浓度14.01%，超声提取时间26.60 min，料液比为1∶43.59 g·mL-1，在此条件下枳壳总黄酮得率理论预测值为18.78 mg·g-1。

Fig.1 Response surface plots and contour plots

2.4 验证实验

按照模型预测的最优条件进行实验，验证所得结果的可靠性。为了方便操作，将最佳方案修改为乙醇浓度14%、提取时间27 min、料液比1∶44 g·mL-1。3次平行试验枳壳总黄酮浸出量分别为18.72、18.91、18.81 mg·g-1，平均值为18.81 mg·g-1，此结果与软件预测值非常接近。表明基于Box-Behnken 设计优化得到的提取条件准确可行，具有实用意义。

3 讨论

利用Box-Behnken 设计对超声辅助提取枳壳总黄酮的工艺条件进行优化，所得二次多项回归方程具有较好的拟合性和可靠性。研究结果表明，超声辅助提取过程中，料液比是影响总黄酮得率的最关键因素，最佳工艺为：乙醇浓度14%、提取时间27 min、料液比1∶44 g·mL-1，此时总黄酮得率为18.81 mg·g-1，与预测值接近，本实验为进一步研究开发枳壳黄酮提供了依据。