翁英华

莆田市秀屿区医院，莆田，351146，中国

非心源性缺血性脑卒中是在老年人群中发病率、致残率、致死率和复发率均居高不下的心脑血管疾病。脑血管血液供应不足可导致脑组织功能障碍，进而发展成脑卒中，并引发神经功能恶化（early neurological deterioration,END）［1-3］。阿托伐他汀钙属于HMGCoA 还原酶抑制剂，是目前临床使用的一线降血脂药，国内外有文献报道阿托伐他汀钙不仅能抗动脉粥样硬化，还可改善神经功能，保护脑组织神经元［4-6］。

本研究通过给脑卒中SD 大鼠灌胃阿托伐他汀，观察阿托伐他汀对其神经功能的影响，并对其作用机理进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

挑选SPF 级SD 雄性大鼠30 只，年龄6～7 w，体质量220～260 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（京）2020-0017。动物空调房温度为24℃，购买后在动物房适应性饲养1 w。数字标记后随机分为3 组：假手术组，模型组和阿托伐他汀组。对模型组和阿托伐他汀组大鼠建立非心源性缺血性脑卒中模型，假手术组不阻塞颈内动脉。

1.2 药物、试剂和仪器

阿托伐他汀，购自于辉瑞制药有限公司，国药准字J20 070060；TUNEL 细胞凋亡试剂盒，购自美国Roche 公司；全自动酶联免疫分析仪及配套的酶联免疫吸附血清炎症因子水平检测试剂盒（白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β，均购自深圳库贝尔生物科技有限公司；大鼠神经元凋亡相关蛋白TLR4、核转录因子NF-κB p65、p-I κB、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）和β-actin 单克隆抗体，均购自美国Santa Cruz 公司。

DYY-1C 型凝胶成像系统，北京六一仪器厂；显微镜，日本Nikon E 公司；CUT4062 型石蜡切片机、包埋机，德国SLEE 公司。

1.3 大鼠造模及给药方法

王会林［7］采用Longa 改良线栓法建立非心源性缺血性脑卒中模型：使用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉（剂量为5 mL·kg-1），麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于手术台，75%酒精消毒大鼠左颈部皮肤和手术器械后，剪开大鼠左颈部皮肤，钝性分离颈部肌群、颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）和颈总动脉（common carotid artery，CCA），用手术线于颈内动脉和颈总动脉分叉处结扎颈外动脉，并用动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉，自颈总动脉结扎处1 cm 用注射器针头刺开一小口，将一端烧圆的鱼线自颈总动脉插入颈内动脉，深入至左侧大脑中动脉起始部位至感受到阻力阻断供血为止，插入深度可达18 mm，扎紧手术线缝合伤口，并消毒防止大鼠出现感染。假手术组仅将无烧圆的线栓的鱼线深入颈内动脉5 mm，其余步骤同模型组。造模成功后，阿托伐他汀组大鼠连续灌胃阿托伐他汀（1 mg·kg-1·d-1）2 w，假手术组和模型组连续灌胃等体积0.9%氯化钠溶液2 w。

1.4 神经功能缺损评估

给药结束后2 d，康瑜等［8］观察各组大鼠神经功能缺损评估：无明显神经功能缺损可自由活动，记为0 分；线栓堵塞对侧的前爪无法完全伸直为1 分；行走时向线栓堵塞对侧无法控制的旋转为2 分；向线栓堵塞对侧无法控制倾倒为3 分；无法自主活动，失去意识为4 分。得分越高，大鼠神经功能缺损越严重。

1.5 取材

大鼠神经功能缺损评估结束后，脱臼处死大鼠，迅速断头取脑，取左侧大脑半球，分为两部分保存，一部分放置于4%多聚甲醛中固定24 h 后，经脱水、浸蜡、包埋和切片，用于HE 染色和末端标记（TUNEL）染色；另一部分放置于-80℃超低温冰箱保存，用于Western blotting 实验。

1.6 各组大鼠脑组织病理切片和神经细胞凋亡变化

脑组织切片后取一份HE 染色封片后显微镜下观察各组大鼠脑组织病理变化，并取5 个不同视野拍照；另取一份用于TUNEL 染色，严格按照试剂盒说明书步骤操作，显微镜下观察并取5 个不同视野拍照。并对视野下凋亡神经元和总神经元进行细胞计数，计算两者比值为细胞凋亡率。

1.7 血清炎症因子水平检测

取大鼠动脉血，4 000 r·min-1离心10 min 后取血清，酶联免疫吸附法进行血清炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平检测，严格遵照说明书操作。

1.8 Western blotting 法观察各组大鼠脑组织神经元细胞凋亡相关蛋白表达

取受损脑皮层组织50 mg，匀浆裂解提取总蛋白，测定蛋白浓度，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质样品，将蛋白转移到PVDF 膜上，电泳；进行免疫反应：封闭，孵育一抗，洗涤，孵育二抗，洗涤；用化学发光成像系统对信号进行评价，以检测细胞凋亡相关蛋白TLR4、NF-κB p65、p-IκB 和Cleaved Caspase-3 的表达水平。

1.9 统计学方法

用SPSS 22.0 版软件进行分析，使用均数±标准差（）表示，组间差异用t检验，率的比较用x2检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠神经功能缺损评估比较

神经功能缺损评估结果如Tab.1 显示，模型组（2.79±0.35）分和阿托伐他汀组（1.71±0.25）分得分较假手术组（0.23±0.04）分明显为高（P＜0.05）；而阿托伐他汀组较模型组得分明显为低（P＜0.05）。

Tab.1 Effect of atorvastatin on nerve function in rats with non -cardiac ischemic stroke

2.2 HE 染色病理切片观察阿托伐他汀对非心源性缺血性脑卒中大鼠脑组织损伤的影响

HE 染色病理切片的结果显示（Fig.1），假手术组大鼠脑组织未见明显病理改变，细胞结构完整；模型组细胞组织之间有明显的间隙，有神经元变性且排列紊乱；阿托伐他汀组神经元排列和神经元之间的空隙明显较模型组改善，表明脑组织损伤较模型组减轻。

Fig.1 Observation of brain histopathology differences in rats with HE staining

2.3 TUNEL 染色观察阿托伐他汀对非心源性缺血性脑卒中大鼠神经元凋亡的影响

TUNEL 染色结果如Fig.2 显示，模型组大鼠脑组织神经元细胞凋亡明显，凋亡率为（49.25±9.21）%，阿托伐他汀组大鼠脑组织神经元细胞凋亡较轻，凋亡率为（33.73±8.27）%，二者神经元凋亡率较假手术组（13.28±3.14）%明显增高（P＜0.05）；而阿托伐他汀组较模型组神经元凋亡率明显降低（P＜0.05）。

Fig.2 Apoptosis of neurons in brain tissue of rats with TUNEL staining

2.4 阿托伐他汀对非心源性缺血性脑卒中大鼠血清炎症因子水平的影响

如Tab.2 所示，模型组和阿托伐他汀组IL-6、TNF-α和IL-1β水平较假手术组明显增高（P＜0.05）；而阿托伐他汀组较模型组IL-6、TNF-α和IL-1β水平明显降低（P＜0.05）。

Tab.2 Effect of atorvastatin on serum inflammatory factor levels in non-cardiac ischemic stroke rats

2.5 阿托伐他汀对非心源性缺血性脑卒中大鼠脑组织TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响

如Fig.3、Tab.3 所示，模型组和阿托伐他汀组TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表达较假手术组明显上调（P＜0.05）；而阿托伐他汀组TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表达较模型组明显下调（P＜0.05）。

Tab.3 Effects of atorvastatin on TLR4、NF-κB p65、p-IκB、Cleaved Caspase-3 protein expression in brain tissue of non-cardiac ischemic stroke rats

Fig.3 Effects of atorvastatin on TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 protein expression in brain tissue of non-cardiac ischemic stroke rats.

3 讨论

随着医疗技术的进步，心脑血管疾病的研究有了很大进展，然而缺血性脑卒中致死率致残率仍然居高不下，且目前尚无普遍适用的治疗方法［9］。缺血性脑卒中患者常伴有认识、感觉及运动功能障碍，临床表现为偏瘫、神经功能症状、语言和记忆障碍。

阿托伐他汀钙是临床使用最广泛的HMG-CoA 还原酶抑制剂，可抑制胆固醇的生成，降低血脂，是缺血性脑血管病的二级预防药物。近年来，有报道HMGCoA 还原酶抑制剂（他汀类药物）可通过调控脂质代谢缓解脑部血流状况来有效减轻脑梗死患者的神经功能缺陷，保护脑组织，改善神经功能［10］。本文结果证实阿托伐他汀钙可显著改善神经功能障碍，抑制非心源性缺血性脑卒中大鼠神经元细胞凋亡。

有研究报道神经细胞的凋亡和炎症反应在缺血性脑卒中发挥关键的作用，IL-6、TNF-α和IL-1β是临床常见的炎症因子，可有效反映患者的炎症反应严重程度［4，11］。本研究中，阿托伐他汀组IL-6、TNF-α和IL-1β较模型组明显降低，同时细胞凋亡的状况较模型组也得到明显改善，表明阿托伐他汀可抑制IL-6、TNF-α和IL-1β等炎症因子的产生，以减轻对神经细胞的伤害，抑制细胞凋亡，使缺血性脑卒中的疗效更好。

杨晓炜等［12］的研究显示阿托伐他汀可通过下调TLR4/NF-κB 通路减少TNF-α等炎症因子的生成释放。另外，I κB 激活磷酸化生成p-I κB，可释放NF-κB p65，也可增加IL-6、TNF-α和IL-1β的释放，使炎症反应加剧［13］。本研究Western blotting 免疫印迹结果显示阿托伐他汀可明显下调TLR4、NF-κB p65、p-I κB、Cleaved Caspase-3 的表达，与已有的研究结果吻合。

综上，阿托伐他汀钙能够抑制TLR4 和核转录因子NF-κB p65 的表达，通过该途径抑制非心源性缺血性脑卒中大鼠神经元细胞凋亡，改善神经功能障碍。