周 卿，陆莹华，燕 飞

(1.遵义医科大学 药学院药物分析教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 药学院2014级学生，贵州 遵义 563099)

在失眠症状的治疗方法中，中医药治疗因具有疗效稳定，安全、无毒、副作用小等特点而日益成为临床常用的手段之一。大量研究也显示，许多中草药具有天然的镇静安神及催眠的功效，可以较好地调节睡眠功能[1-4]。复方钩藤口服液由钩藤、天麻、酸枣仁、远志、山萸肉5味药材组成，是地方名医的经验方，经多年临床使用，疗效明确，具有较好地改善睡眠的作用，为方便药物的服用，经剂型改进为口服液制剂。组方中钩藤味甘性凉，可清热平肝，息风定惊，具有镇静，降压作用[5-7]。天麻甘平柔润，亦可息风定惊，具有镇静、抗惊厥、抗焦虑功效，二者为主药，合用可平肝息风，镇静安神[8-10]；辅以的酸枣仁是镇静助眠佳品，甘酸质润，可养血补肝[11-12]；远志味苦性温，常用于心肾不交引起的失眠多梦，健忘惊悸的治疗等[13]；山萸肉可补益肝肾，收敛固涩；几味药合用可起到宁心除烦、镇静安神的功效。为保证临床用药的安全性和可控性，本研究采用薄层色谱法对复方钩藤口服液中的钩藤、天麻和酸枣仁进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法测定该口服液中的钩藤碱和天麻素的含量，以期较全面有效地控制、评价复方钩藤口服液的质量[14]。

1 材料

1.1 仪器 RE-2000E型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；pH计(美国EUTEOH公司)；BT125D型分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；SG3300HE型超声清洗仪(上海冠特有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 药品与试剂 复方钩藤口服液(遵义医科大学药学院药物分析实验室自制，批号20170721、20170805、20170827，规格：10mL/只)；钩藤碱(批号：150907)，异钩藤碱(批号：16032)，天麻素(批号：150518)，酸枣仁皂苷A(批号：160513)，酸枣仁皂苷B(批号：160820)，钩藤对照药材(批号：121190)均购自北京世纪奥科生物技术有限公司；钩藤药材购自贵州省剑河县，天麻、酸枣仁、远志、山萸肉、甘草药材均购自遵义中药饮片公司，经遵义医科大学附属医院药剂科杨建文主任药师鉴定为真品。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自迪马科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 复方钩藤口服液的制备 取组方中的药材加水浸泡30 min，以水为药材质量的12倍分别提取3次(钩藤在第一次煎煮后20 min加入)，合并煎煮滤液，减压浓缩至含生药为1 g/mL，加乙醇至含醇量为70 %，醇沉24 h，过滤，减压浓缩至无醇味，加水调节浓度至含生药0.5 g/mL，放置15 h后，过滤，滤液用10 %氢氧化钠调节pH值为5.0，加入0.15 %的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的等量混合物，搅拌均匀，高温灭菌，灌装即得复方钩藤口服液。

2.2 复方钩藤口服液的定性鉴别

2.2.1 钩藤药材的鉴别 取钩藤药材粉碎，过40目筛，精密称取1.0 g，加入氨水1 mL浸泡30 min后，加入25.0 mL三氯甲烷加热回流2 h，过滤，滤液蒸干，所得残渣加1.0 mL甲醇溶解，作为钩藤药材的供试品溶液；另取钩藤对照药材1.0 g，采用上述钩藤药材供试品溶液制备方法得到钩藤对照药材溶液。精密取钩藤碱、异钩藤碱对照品，分别加甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL溶液，作为钩藤碱和异钩藤碱的对照品溶液。分别吸取上述4种溶液各10 μL，点于同一薄层硅胶G板上，以石油醚-丙酮(6∶4，V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，置于254 nm紫外光灯下检视[15]。结果从色谱图1可知，钩藤药材供试品溶液、钩藤对照药材溶液与其钩藤碱和异钩藤碱的对照品溶液在对应位置上显相同斑点。

1：钩藤碱对照品；2：异钩藤碱对照品；3：钩藤药材；4：钩藤对照药材。

2.2.2 口服液中钩藤的鉴别 取复方钩藤口服液20 mL，用氨水调节pH至10.0，加100 mL三氯甲烷，加热回流1 h，取上层溶液重复用50 mL三氯甲烷加热回流1 h，合并两次下层溶液，蒸干后残渣用0.5 mL甲醇溶解作为钩藤供试品溶液。按复方钩藤口服液的处方除去钩藤后，制备缺钩藤的阴性对照口服液，同上述方法制得缺钩藤的阴性样品溶液。取钩藤碱、异钩藤碱对照品，分别加甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL的溶液，作为钩藤碱和异钩藤碱的对照品溶液。分别吸取上述4种溶液各10μL，点于同一薄层硅胶G板上，以石油醚-丙酮(6∶4,V/V)为展开剂，展开，取出，晾干后置于254 nm紫外光灯下检视[15]。结果从色谱图2可知，复方钩藤口服液与钩藤碱和异钩藤碱对照品溶液在对应位置均显相同斑点，而缺钩藤的阴性对照溶液不显斑点，不干扰测定。

1：钩藤碱对照品；2：异钩藤碱对照品；3～5：钩藤供试品；6：阴性对照品。

2.2.3 口服液中天麻的鉴别 取复方钩藤口服液10 mL，蒸干，残渣用1 mL甲醇溶解作为天麻供试品溶液。按复方钩藤口服液的处方除去天麻后，制备缺天麻的阴性对照口服液，同上述方法制得缺天麻的阴性样品溶液。精密称取天麻素对照品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液，作为天麻素对照品溶液。分别吸取上述3种溶液各10 μL，点于同一薄层硅胶G板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1∶0.2，V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸的乙醇溶液，于110 ℃加热至斑点显清晰颜色[15]。结果从色谱图3可知，复方钩藤口服液与天麻素对照品溶液在对应位置显相同颜色斑点，缺天麻的阴性对照溶液不显斑点，不干扰测定。

1：天麻素对照品；2～4：天麻供试品；5：阴性对照品。

2.2.4 口服液中酸枣仁的鉴别 取复方钩藤口服液10 mL，蒸干，残渣用1 mL甲醇溶解作为酸枣仁供试品溶液。按复方钩藤口服液的处方除去酸枣仁后，制备缺酸枣仁的阴性对照口服液，同上述方法制得缺酸枣仁的阴性样品溶液。分别精密称取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的对照品，分别用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液，作为酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B对照品溶液。分别吸取上述4种溶液各10μL，点于同一薄层硅胶G板上，以水饱和的正丁醇溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，于110 ℃加热至斑点显清晰颜色[15]。结果从色谱图4可知，复方钩藤口服液与酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B对照品溶液在对应位置显相同斑点，而缺酸枣仁的阴性对照溶液不显斑点，不干扰测定。

1：酸枣仁皂苷A对照品；2：酸枣仁皂苷B对照品;3～5：酸枣仁供试品；6：阴性对照品。

2.3 复方钩藤口服液中钩藤碱含量的测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为乙腈(A):0.05 %冰醋酸缓冲液(加三乙胺调节pH为7.5)(B)，梯度洗脱(0 min，40 % A；8 min，50 % A；20 min，60 %A；24 min，80 % A)；流速为1.0 mL/min；检测波长为243 nm；柱温为25 ℃；进样量为20 μL。

2.3.2 溶液的配制 ①对照品溶液的配制：取钩藤碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定容至10 mL，制成浓度为1.84 mg/mL的对照品溶液。②供试品溶液的配制：精密量取复方钩藤口服液10.0 mL，经微孔滤膜(0.22 μm)过滤，置于4 ℃条件下储藏待用。③阴性对照溶液的配制：按复方钩藤口服液的处方除去钩藤后，按其制备工艺制成缺钩藤的阴性样品溶液，精密量取10.0mL经微孔滤膜(0.22 μm)过滤，即得。

2.3.3 系统适应性试验 取“2.3.2”项下各溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别进样20 μL，色谱图见图5。结果显示，钩藤碱保留时间为9.7 min，理论塔板数按钩藤碱峰计不低于3 000，分离度大于1.5，阴性对照溶液在钩藤碱对照品相同保留时间处无色谱峰出现，表明样品中其它成分不干扰钩藤碱的测定。

A：钩藤碱对照品；B：复方钩藤口服液；C：缺钩藤阴性样品；a：钩藤碱。

2.3.4 线性关系考察 精密量取钩藤碱对照品溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为0.92、3.68、7.36、11.04、14.78、18.40 μg/mL 的对照品系列溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别进样分析，记录色谱峰峰面积，以对照品溶液浓度C(μg/mL)为横坐标，对照品的峰面积 A为纵坐标进行线性回归，线性方程为A=46.36×C+13.44(r=0.999 2)，结果表明钩藤碱在0.92 μg/mL～18.40μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.3.5 定量限和检测限的考察 精密量取钩藤碱对照品溶液，用甲醇稀释定容配制成浓度为0.92 μg/mL 的溶液，逐级稀释，稀释后溶液分别在“2.3.1”色谱条件下进样分析测定，记录峰面积，以信噪比为10∶1计算钩藤碱的定量限，以信噪比为3∶1计算钩藤碱的检测限。结果，钩藤碱的定量限为0.92 μg/mL，检测限为0.18 μg/mL。

2.3.6 精密度试验 精密量取“2.3.2”项下对照品溶液，配制成浓度为11.04 μg/mL的钩藤碱对照品溶液，在上述色谱条件下重复测定6次，以峰面积的RSD值表示精密度。结果，钩藤碱峰面积的RSD值为0.20%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 重复性试验 取复方钩藤口服液(批号：20170805)6份，按上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别进样测定，以钩藤碱含量的RSD值表示方法的重复性。结果，钩藤碱含量的RSD值为2.73%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取已知含量的复方钩藤口服液9份(批号：20170805)，每份5.0 mL，分别加入高、中、低三种浓度的钩藤碱对照品溶液适量，加甲醇定容至10 mL，按上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，分别按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，计算加样回收率，结果见表1。

2.3.9 稳定性试验 精密量取复方钩藤口服液(批号：20170805)，按上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h时，分别在上述色谱条件下进样分析。结果，钩藤碱峰面积的RSD值为1.85%，表明复方钩藤口服液中钩藤碱在24 h内基本稳定。

2.3.10 样品中钩藤碱含量测定 取3批复方钩藤口服液，按上述方法测定口服液中钩藤碱的含量，结果见表2，可知3批复方钩藤口服液中钩藤碱的平均含量为13.69μg/mL。

2.4 复方钩藤口服液中天麻素含量的测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为乙腈∶水(3∶97)；流速1.0 mL/min；检测波长220 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。

2.4.2 溶液的配制 ①对照品溶液的配制：取天麻素对照品适量，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至10 mL，制成浓度为2.65 mg/mL的对照品溶液；②供试品溶液的配制：精密量取1.0 mL复方钩藤口服液，用蒸馏水稀释10倍后，经微孔滤膜(0.22 μm)过滤，置于4 ℃条件下储藏待用；③阴性对照溶液的配制：按复方钩藤口服液的处方除去天麻后，按其制备工艺制成缺天麻的阴性样品溶液，精密量取1.0 mL用蒸馏水稀释10倍后，经微孔滤膜(0.22 μm)过滤，即得。

2.4.3 系统适应性试验 取“2.4.2”项下各溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别进样分析，色谱图见图6。结果显示，天麻素保留时间为8.7 min，理论塔板数按天麻素峰计不低于3 000，分离度大于1.5，阴性对照溶液在天麻素对照品相同保留时间处无色谱峰出现，表明样品中其它成分不干扰天麻素的测定。

A：天麻素对照品；B：复方钩藤口服液；C：缺天麻阴性样品；b：天麻素。

2.4.4 线性关系考察 精密量取天麻素对照品溶液适量，用蒸馏水稀释成质量浓度分别为13.25、53.00、106.00、159.00、212.00、265.00 μg/mL 的对照品系列溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别进样分析，记录色谱峰峰面积，以对照品溶液浓度C(μg/mL)为横坐标，对照品的峰面积 A为纵坐标进行线性回归,线性方程为A=35.17×C-8.39(r= 0.999 8)，结果表明天麻素在13.25 μg/mL～265.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.4.5 定量限和检测限的考察 精密量取天麻素对照品溶液，用甲醇稀释定容配制成浓度为13.25 μg/mL 的溶液，逐级稀释，稀释后溶液分别在“2.4.1”项色谱条件下进样分析测定，记录峰面积，以信噪比为10∶1计算天麻素的定量限，以信噪比为3∶1计算天麻素的检测限。结果，天麻素的定量限为1.33μg/mL，检测限为0.26μg/mL。

2.4.6 精密度试验 精密量取“2.4.2”项下天麻素对照品溶液，配制成浓度为159.00μg/mL的天麻素对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，以峰面积的RSD值表示精密度。结果，天麻素峰面积的RSD值为0.30%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 重复性试验 取复方钩藤口服液(批号：20170805)6份，按上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样分析测定，以天麻素含量的RSD值表示方法的重复性。结果，天麻素含量的RSD值为0.60%，表明方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取已知含量的复方钩藤口服液9份(批号：20170805)，每份5.0 mL，分别加入高、中、低三种浓度的天麻素对照品溶液适量，加蒸馏水定容至10 mL，按上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样分析测定，计算加样回收率，结果(见表1)。

表1 加样回收率测定结果(n=9)

2.4.9 稳定性试验 精密量取量取复方钩藤口服液(批号：20170805)，按上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h时，分别在“2.4.1”项色谱条件下进样分析测定，天麻素峰面积的RSD值为0.99%，结果表明复方钩藤口服液中天麻素在24 h内基本稳定。

2.4.10 样品中天麻素含量测定 取3批口服液，按上述方法测定口服液中天麻素的含量，结果见表2，可知3批复方钩藤口服液中天麻素的平均含量为1294.6 μg/mL。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

钩藤碱、异钩藤碱均是钩藤中的主要药效成分，二者为同分异构体，在煎煮过程中易相互转换[16]，中国药典中对于钩藤药材的定性鉴别仅采用了以异钩藤碱为检测指标[15]，为全面控制钩藤药材的质量，在本试验中同时定性鉴别了钩藤碱和异钩藤碱，采用紫外灯光观察，结果表明两个成分分离完全，斑点清晰。在钩藤碱的含量测定方法中，比较了文献中[17-19]的流动相，如甲醇-0.02%三乙胺、甲醇-水(含0.01 mol/L三乙胺，冰醋酸调 pH值至 7.5)、甲醇-水等均不能使口服液中的钩藤碱与其他组分完全分离，后采用在0.05%的冰醋酸溶液中加入0.07%的氨水，再加三乙胺调节pH为7.5，钩藤碱与口服液中其他组分得以分离完全。同时在检测中发现异钩藤碱的含量远低于钩藤碱，故选择钩藤碱作为该口服液中含量测定的指标之一。在天麻素的含量测定方法中，由于天麻素极性较大，所用流动相的极性也较大，对常规色谱柱有损害，而选择专用适合极性化合物分离的色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq较好地解决了这一问题，且基线平稳，色谱峰峰型良好。

综上所述，本试验建立了复方钩藤口服液中钩藤碱、天麻素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的薄层色谱鉴别法；建立了复方钩藤口服液中钩藤碱、天麻素含量测定的高效液相色谱法，含量限度以-20%为下限[20]，再综合考虑药材来源的差异，确定口服液中钩藤碱的含量不得低于10.0 μg/mL，天麻素的含量不得低于1 000.0 μg/mL。所建立的方法准确可靠，可用于复方钩藤口服液的质量控制。