汪爱霞，孙 芸，郭文宾

（1. 甘肃河西制药有限责任公司，甘肃 张掖 734000； 2. 甘肃省张掖市食品药品检验检测中心，甘肃 张掖 734000）

滋阴补肾丸为包衣水丸，由生晒参、五味子（制）、山药、锁阳、黄芪、巴戟天、山茱萸等中药组方，具有滋阴壮阳、益精填髓功效，主要用于腰膝酸痛、梦遗滑精、阳痿早泄等症。该制剂收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第七册）》，有显微鉴别项，无其他定性或定量指标。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对人参、山药、五味子、山茱萸对照药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定黄芪中黄芪甲苷的含量［1-10］，为该制剂的质量控制提供检验依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2030 型高效液相色谱仪，包括SIL-20AC 自动进样器、LC-20AD 四元泵、CTO-20AC 柱温箱（日本岛津公司）；Alltech 6000 型蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）；AG-135 型电子天平（精度为十万分之一），ME204E 型电子天平（精度为万分之一），均由梅特勒-托利多仪器有限公司提供；ZFC-2 型三用紫外分析仪（上海康禾光电仪器有限公司）；KQ5200DE 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为240 W，频率为45 kHz）。

1.2 试药

人参皂苷Rb1对照品（批号为110704-201827），人参皂苷Rg1对照品（批号为110703-201731），人参皂苷Re 对照品（批号为110754-201827），黄芪甲苷对照品（批号为110781-200613，含量以100%计），五味子醇甲对照品（批号为110857-201714），熊果酸对照品（批号为110742-200517），人参对照药材（批号为120917-201110），五味子对照药材（批号为120922-201610），山药对照药材（批号为121137-201606），山茱萸对照药材（批号为121495-201303），均购自中国食品药品检定研究院；滋阴补肾丸（甘肃河西制药有限责任公司，批号分别为170501，170502，171201，规格为每袋5 g）；阴性样品（甘肃河西制药有限责任公司自制）；硅胶GF254薄层板（批号为20180803），硅胶G 薄层板（批号为20190506），均购自青岛海洋化工厂；甲醇（批号为63Y1811CR，纯度为99.9%），乙腈（批号为32Y1906HB，纯度为99.9%），均为色谱纯，均购自美国ACS 恩科化学有限公司，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

人参和黄芪：取样品适量，研细，取约6 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取7 h，提取液回收甲醇至干，残渣加水25 mL，微热使溶解，用乙醚轻摇洗涤2 次，每次20 mL；水溶液再用水饱和的正丁醇振摇提取6 次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3 次，每次40 mL，正丁醇液回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法制备人参对照药材溶液。再取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re 对照品及黄芪甲苷对照品，分别加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。取不含人参和黄芪的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液与对照药材溶液各10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15 ∶40 ∶22 ∶10，V/ V/ V/ V）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，展距18 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1。

图1 人参和黄芪薄层色谱图

五味子：取样品6 g，研细，加70%甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣用0.1 mol / L 的氢氧化钠溶液20 mL 溶解，用乙酸乙酯振摇提取2 次，每次20 mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取五味子对照药材1 g，同法制备对照药材溶液。再取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。取不含五味子的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（30 ～60 ℃）-甲酸乙酯-甲醇（15 ∶5 ∶0.3，V/ V/ V）为展开剂，展开，展距15 cm，取出，晾干，在紫外光（254 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图2 A。

山药：取样品5g，研细，加甲醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加水20 mL 使溶解，再加盐酸1 mL，加热回流1 h，冷却，用三氯甲烷振摇提取2 次，每次25 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取山药对照药材2 g，同法制备对照药材溶液。取不含山药的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-丙酮（9 ∶1.5，V/ V）为展开剂，展开，展距17 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图2 B。

图2 五味子、山药和山茱萸薄层色谱图

图3 高效液相色谱-蒸发光散射检测器色谱图

山茱萸：取样品5 g，研细，加水30 mL，放置使溶散，用滤纸滤过，药渣再用水30 mL 洗涤，在室温干燥至呈松软的粉末状，于100 ℃烘干，连同滤纸一并置索氏提取器内，加乙醚适量，加热回流提取4 h，提取液回收乙醚至干，残渣用石油醚（30 ～60 ℃）浸泡2 次，每次15 mL（浸泡约2 min），倾去石油醚，残渣加无水乙醇-三氯甲烷（3 ∶2，V/ V）混合液3 mL，微热使溶解，作为供试品溶液。取山茱萸对照药材1 g，加乙酸乙酯10 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2 mL 使溶解，作为对照药材溶液。另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。取不含山茱萸的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（20 ∶5 ∶8，V/ V/ V）为展开剂，展开，展距8 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图2 C。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：HypersilODS2C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（35 ∶65，V/ V）；检测器：蒸发光散射检测器；流速：1 mL / min；N2流速：2.7 L / min；柱温：30 ℃；进样量：5，20 μL；雾化器温度：99.3 ℃。

2.2.2 溶液制备

取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作为对照品贮备溶液。精密量取对照品贮备液5 mL，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，即得对照品溶液。按2.1 项下方法制备供试品溶液。取不含黄芪药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2.2 项下3 种溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果阴性对照无干扰，专属性强。色谱图见图3。

线性关系考察：取黄芪甲苷对照品11.31 mg，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，得对照品母液（质量浓度为0.226 2 mg/mL），再分别精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，稀释成不同质量浓度的对照品溶液，按拟订色谱条件分别进样10 μL，测定色谱峰，计录色谱峰面积，以黄芪甲苷进样量的对数（X）为横坐标、峰面积积分值的常用对数（Y）为纵坐标作标准曲线，得黄芪甲苷回归方程Y=1.570 3X+5.529 5，r=0.999 0 （n=6）。结果表明，黄芪甲苷进样量在11.31 ～67.86 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，2，4，6，12，24 h 时进样20 μL 测定，记录黄芪甲苷色谱峰的峰面积。结果的RSD为0.66%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

精密度试验：精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6 次，按拟订色谱条件测定峰面积。结果的RSD为0.14%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为171201）样品共6 份，精密称定，依法制备供试品溶液，并测定含量。结果黄芪甲苷平均含量为0.070 mg/g，RSD为2.16%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为171201）3.0 g，精密称定，共9 份，分别精密加入2.2.2项下高、中、低剂量的黄芪甲苷对照品贮备液，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收试验结果（n=9）

2.2.4 样品含量测定

取滋阴补肾丸3 批，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，以外标两点法对数方程计算含量。结果批号分别为170501，170502，171201 的3 批样品中黄芪甲苷含量分别为0.066 9，0.067 4，0.070 0 mg/g，平均0.068 1 mg/g。

3 讨论

3.1 提取条件优化

通过试验，对提取溶剂（甲醇、70% 甲醇溶液和50%甲醇溶液）、提取方法（超声、索氏提取）和提取时间（4 h 和7 h）进行比较。结果表明，用甲醇索氏提取7 h为最优提取条件。

3.2 测定方法选择

黄芪甲苷含量测定方法有HPLC 法（紫外检测器与蒸发光散射检测器）、薄层扫描法、荧光法等［11-13］。该制剂药味较多，成分复杂，薄层色谱定量测定方法重复性及稳定性较差，选用薄层色谱法进行黄芪甲苷定性鉴别。黄芪甲苷属四环三萜类皂苷，λmax为200.08 nm，为紫外末端吸收，紫外检测灵敏度低，干扰因素多［14］，不适用于紫外检测器。HPLC 法（蒸发光散射检测器）为质量型通用检测器，其响应大小决定于被分析物质颗粒的数量和大小，而不受流动相溶剂的干扰，不要求被检测组分有特定的化学结构［15］，适用于结构中无共轭体系、紫外吸收较弱的化合物，选用该方法灵敏度高，重复性好，结果无干扰。