常 乐

（长治职业技术学院生物工程系，山西长治 046011）

牧草是反刍动物正常瘤胃功能所必需的，为反刍动物提供一种更经济有效的饲养方式。但牧草中高比例的结构性碳水化合物限制了反刍动物对牧草的自由采食和消化，因为它们减慢了微生物的发酵速度。瘤胃微生物，尤其是纤维素分解菌和厌氧真菌的数量和多样性是降解日粮纤维成分的必要条件（Wilson，2008）。因此，一种促进纤维降解微生物生长的方法将有利于增加瘤胃中纤维素和半纤维素的降解。大多数瘤胃纤维素降解微生物（如白瘤胃球菌、风味瘤胃球菌、琥珀纤维杆菌和丁里维生物纤维隔离菌）都需要支链挥发性脂肪酸，如异丁酸、异戊酸和2-甲基丁酸（侯明杰等，2018）。瘤胃支链挥发性脂肪酸主要来源于日粮蛋白或细菌蛋白经瘤胃氧化脱氨和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸脱羧后的循环。Moharrery（2004）研究表明，支链挥发性脂肪酸可以提高绵羊瘤胃的干物质表观消化率和微生物生长，增强微生物功能和酶活性。支链挥发性脂肪酸可以、用于合成支链氨基酸，即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。氨基酸通常对瘤胃微生物具有刺激作用，即使氨和碳水化合物超出所需，说明氨基酸直接影响瘤胃微生物的生长速率。Yang（2002）在体外试验中发现，支链挥发性脂肪酸显著提高了牧草中性洗涤纤消化率，而支链氨基酸的效果更佳。但每种支链氨基酸用于瘤胃发酵和底物降解的最佳剂量仍然未知。支链氨基酸对纤维物质体外降解的数据较为有限。因此，本试验评估了不同剂量的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸对小麦秸秆体外瘤胃发酵特性的影响。

1 材料与方法

1.1 瘤胃液接种试验选择4头带有瘤胃瘘管的绵羊作为瘤胃液供体，饲喂商品浓缩料和补充小麦秸秆。在早上饲喂前从瘤胃瘘管收集内容物，经4层纱布过滤去除饲料颗粒。过滤后的瘤胃液转移到一个预加热（38℃）的保温瓶中，并与二氧化碳混合，并加入缓冲液。

1.2 样品孵育取1 g小麦秸秆样品放入125 mL血清瓶。在每个发酵瓶中加入称重的缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，配制成浓度梯度为1、3、5和7 mmol/L。将100 mL瘤胃液加入到瓶中，用二氧化碳冲洗，之后装上塞子，密封，并在38℃的水浴摇床（100 rpm/min）。未添加支链氨基酸的瓶子作为对照组，每组3个重复。孵育72 h后，用自来水冷却，停止发酵。用pH计测定培育基的pH。用尼龙袋过滤每个瓶子的内容物，收集底物残渣测定干物质和中性洗涤纤维。收集每个过滤发酵液10 mL，用于测定氨氮和挥发性脂肪酸浓度（Filipek 和 Dvorak，2009）。

1.3 统计分析数据采用SPSS软件一般线性模型进行分析，采用Duncan’s法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，同时利用正交多项式分析支链氨基酸添加水平的线性和二次曲线效应。

2 结果与分析

2.1 缬氨酸对小麦秸秆体外发酵性能的影响由表1可知，添加缬氨酸对培养基的最终pH无显著影响（P＞0.05）。氨氮浓度随缬氨酸添加水平的增加有显著上升趋势（P=0.06）。与对照组相比，缬氨酸浓度在1 mmol/L或更高水平时，挥发性脂肪酸产量显著增加（P＜0.05）。挥发性脂肪酸总量和支链挥发性脂肪酸浓度与缬氨酸添加水平表现为显著线性和二次曲线效应（P＜0.05）。除乙酸、异戊酸及乙酸与丙酸比值外，丙酸、丁酸、异丁酸和戊酸浓度随缬氨酸水平的增加表现为显著线性效应（P＜0.05）。缬氨酸添加水平对干物质和中性洗涤纤维体外降解量均无显著影响（P＞ 0.05）。

2.2 亮氨酸对小麦秸秆体外发酵性能的影响由表2可知，随着亮氨酸水平的升高，pH有显著升高趋势（P=0.06），同时氨氮和支链挥发性脂肪酸浓度表现为显著线性升高（P＜0.05），而挥发性脂肪酸总量表现为显著二次曲线效应（P＜0.05）。乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸浓度随亮氨酸水平的升高表现为显著线性和二次曲线效应（P＜0.05），而戊酸和乙酸与丙酸比值表现为显著二次曲线效应（P＜0.05），异戊酸表现为显著线性升高效应（P＜0.05）。亮氨酸添加水平对干物质和有机物体外降解量均无显著影响（P＞0.05）。

表1 缬氨酸对小麦秸秆体外发酵性能的影响

表2 亮氨酸对小麦秸秆体外发酵性能的影响

2.3 异亮氨酸对小麦秸秆体外发酵性能的影响由表3可知，pH和挥发性脂肪酸总量随异亮氨酸水平的升高表现为显著线性和二次曲线效应（P＜0.05），而支链挥发性脂肪酸浓度表现为显著线性升高（P＜0.05）。异亮氨酸添加水平对氨氮浓度无显著影响（P＞0.05）。随着异亮氨酸添加水平的升高，乙酸、丙酸、异戊酸及乙酸与丙酸比值均表现为显著线性降低（P＜0.05），而丁酸、异丁酸和异戊酸浓度表现为显著线性和二次曲线效应（P＜0.05）。戊酸浓度不受异亮氨酸添加水平的影响（P＞0.05）。随着异亮氨酸添加水平的升高，干物质和中性洗涤纤维体外降解量有显著降低的趋势（P=0.08，P=0.07）。

表3 异亮氨酸对小麦秸秆体外发酵性能的影响

3 讨论

Wang等（2008）研究发现，当所有支链氨基酸从发酵培养基中去除后，瘤胃细菌和原生动物的生长受到抑制，微生物蛋白产量下降44.52%，说明支链氨基酸是瘤胃微生物生长所必需的氨基酸。与其他氨基酸相比，瘤胃微生物更难合成亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸，因此，考虑到纤维素分解菌的生长和日粮结构碳水化合物的降解，有必要向饲喂牧草的反刍动物提供支链氨基酸。在本研究中，低浓度（1 mmol/L）缬氨酸和异亮氨酸提高了小麦秸秆中性洗涤纤维的降解性，这与Yang（2002）的研究结果一致。但当添加缬氨酸和异亮氨酸的浓度超过1 mmol/L时，小麦秸秆的干物质和中性洗涤纤维消化率有下降趋势，因此，瘤胃微生物体外纤维的最佳浓度约为1 mmol/L。

添加支链氨基酸对瘤胃体外发酵的影响尚不清楚，在本研究中，通过补充缬氨酸或异亮氨酸，挥发性脂肪酸总量、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的浓度增加，这与Zain等（2008）的研究结果一致。挥发性脂肪酸的增加是由于底物降解加速和支链氨基酸代谢增加所致。亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸在瘤胃内被厌氧细菌广泛代谢，产生大量的异戊酸、2-甲基丁酸和异丁酸，这3种支链挥发性脂肪酸是瘤胃中大多数纤维降解微生物的必需生长因子（冯仰廉，2004）。在本研究中，支链挥发性脂肪酸产量随支链氨基酸添加量的增加而线性增加。添加支链氨基酸增加了挥发性脂肪酸的总浓度，但最终的pH保持不变。

人们一直认为，纤维素分解瘤胃细菌利用氨作为唯一的氮源。但越来越多的研究与这一结论并不一致（Atasoglu等，2001），其发现苯丙氨酸对产琥珀酸菌基因的生长至关重要。到目前为止，还没有关于个别种类的纤维素分解细菌对支链氨基酸有特殊偏好的报告。本研究发现，添加低水平的支链氨基酸对中性洗涤纤维的降解有有益影响。但还需进一步的纯培养试验来确定支链氨基酸在不同种类的纤维素分解细菌中的偏好和需求。

4 结论

添加低浓度（1 mmo/L）的缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，可使小麦秸秆的体外发酵产生较高的挥发性脂肪酸。但还需进一步的体内试验来探讨支链氨基酸作为提高反刍动物饲料利用率的添加效果。