田由京 张浩 陈兴超 李军 李合

(海南医学院第一附属医院普通外科，海南 海口 570102)

微小RNA(miRNA)是在18～24个核苷酸组成的人类进化中高度保守的稳定遗传的短链miRNA分子，其特征为不编码蛋白质。miRNA在人类的多种疾病中都可通过抑制靶基因的转录或蛋白翻译而发挥一定的调控功能，如癌症、糖尿病及其并发症、神经退行性疾病及其他各种疾病〔1〕。miR-195-5p不仅可通过靶向锌指蛋白(ZNF)139调控胃癌细胞的耐药性〔2〕，还参与胃癌细胞的细胞表型变化，但是其在胃癌中的作用机制是否与含有1的同源框(HMBOX)1相关尚且未知。HMBOX1在N-末端含有同源框结构域，在C-末端含有HNF1-N结构域，属于同源框基因家族成员。HMBOX1在不同物种间高度保守〔3〕，并且在人10种正常组织的细胞质和细胞核中检测到，包括大脑、胰腺、肾和肝〔4〕。最近研究报道，HMBOX1在癌症中出现异常表达，其中包括胃癌〔5〕。本研究检测miR-195-5p、HMBOX1在胃癌细胞的表达水平，评估二者对胃癌HGC-27细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响，并揭示miR-195-5p对HMBOX1的靶向作用，旨在阐明其潜在机制。

1 材料与方法

1.1材料 正常胃上皮细胞(GES)-1、胃癌细胞N87、 SGC-7901、HGC-27均购自ATCC；达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司； 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、ECL发光液和放射性免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Matrigel基质胶、Transwell小室购自美国Coming公司；Annexin 异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2细胞培养 将GES-1、SGC-7901、N87、HGC-27细胞在DMEM培养基中培养，其中包含10%胎牛血清，并置于37℃,5% CO2的恒温培养箱中孵育，观察细胞生长至75%融合时，加入胰蛋白酶消化1 min，以1∶3的比例更换新鲜的培养基，每隔1 d传代一次。

1.3脂质体转染与细胞分组 将miR-NC、miR-195-5p、si-NC、si-HMBOX1、miR-195-5p和pcDNA、miR-195-5p和pcDNA-HMBOX1遵循脂质体转染试剂LipofectamineTM2000说明书转染到HGC-27细胞中，分别标记为miR-NC组、miR-195-5p组、si-NC组、si-HMBOX1组、miR-195-5p+pcDNA组、miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1组，用于后续试验。

1.4qRT-PCR实验检测细胞中miR-195-5p、HMBOX1的表达 Trizol法提取GES-1、SGC-7901、N87、HGC-27细胞样本总RNA,RNA的定量采用Nano-Drop 2000微量分光光度计进行测定。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。通过逆转录试剂盒进行逆转录反应，步骤依照试剂盒说明书进行，合成cDNA。以cDNA为模板链，按照反应体系进行扩增，反应结束后，收集Ct值，每个样品收集3次重复的平均值，以2-△△Ct法计算定量结果，测定miR-195-5p、HMBOX1的相对表达水平。

1.5MTT法检测细胞增殖 取1.3中各分组HGC-27细胞，加入20 μl的MTT溶液(5 g/L)，反应3.5～4.0 h，然后弃去上清，每孔加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO)，充分震荡溶解结晶，检测490 nm波长下的细胞吸光度(A)。

1.6Western印迹实验检测细胞中HMBOX1、survivin、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax的蛋白表达 各分组HGC-27细胞中加入裂解液，在冰上裂解，30 min后12 000 r/min离心10 min。吸取上清于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水变性10 min。电泳后通过转膜仪将分离的蛋白转至PVDF膜；将膜在5%脱脂奶粉中封闭，2 h后洗涤膜，加入目的蛋白Ⅰ抗，4℃孵育过夜，次日洗涤膜，加Ⅱ抗，4℃孵育2 h。加增强化学发光液，曝光。

1.7Transwell 实验检测细胞的迁移和侵袭miR-195-5p与HMBOX1 在6孔板中接种HGC-27细胞，密度为106个/孔，常规培养细胞。当其达到90%融合度时，更换为无血清培养基培养12 h。之后调整细胞密度为105个/ml，在上室添加100 μl，下室添加600 μl含血清的培养基，常规培养。24 h后取出小室，用无菌棉签擦除上室内的HGC-27细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，加入甲醇固定，30 min后加入0.1%结晶紫，染色20 min，PBS漂洗2次。置显微镜下观察Transwell小室下表面附着的迁移细胞，随机取3个视野拍照计数，取平均数。

在Transwell小室上室铺适量基质胶，风干后按照上述检测步骤进行操作。最后于显微镜下观察并统计小室下表面附着的侵袭细胞。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡 用500 μl的结合缓冲液悬浮HGC-27细胞，分别加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和5 μl的PI，避光反应20 min，细胞经300目铜筛过滤，在1 h内立即于流式细胞仪进行检测。细胞凋亡率(%)= 早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。

1.9双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-195-5p与HMBOX1的结合力 将HMBOX1 3′非编码区(UTR)-野生型(WT)(含HMBOX1 3′UTR片段)和HMBOX1 3′ UTR-突变型(MUT)的荧光素酶报告载体，利用LipofectamineTM2000转染试剂分别与miR-195-5p或miR-NC共转染，转染24 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作，分别记录萤火虫和海肾的荧光素酶激发值，以二者的比值分析miR-195-5p与HMBOX1之间的结合力。

1.10统计学处理 采用SPSS21.0软件进行方差分析，t检验。

2 结 果

2.1胃癌细胞中miR-195-5p、HMBOX1的表达 与GES-1组相比，SGC-7901组、N87组、HGC-27组细胞中miR-195-5p mRNA表达均明显减少，而HMBOX1 mRNA和蛋白表达均明显增加(P<0.05)。最适细胞选定为HGC-27细胞。见图1，表1。

图1 HMBOX1在胃癌细胞中的表达

表1 miR-195-5p、HMBOX1在胃癌细胞中的表达

2.2过表达miR-195-5p对胃癌细胞HGC-27增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-195-5p组胃癌HGC-27细胞中miR-195-5p表达明显增加，细胞活性显著降低，细胞迁移和侵袭量明显减少，细胞凋亡率显著升高(均P<0.001)。见表2。

表2 过表达miR-195-5p对胃癌细胞增殖迁移侵袭及凋亡的影响

2.3两组survivin、P21、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax蛋白表达比较 与miR-NC组比较，miR-195-5p组胃癌HGC-27细胞的survivin、MMP2、MMP9、Bcl-2蛋白表达均明显降低，P21、Bax的蛋白表达则显著升高(均P<0.001)。见表3，图2。

表3 两组survivin、P21、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

图2 过表达miR-195-5p的HGC-27细胞中相关蛋白的表达

2.4miR-195-5p靶向HMBOX1 生物信息学分析预测结果如图3所示，miR-195-5p与HMBOX1的部分碱基存在互补配对现象。miR-195-5p组WT-HMBOX1细胞荧光活性显著低于miR-NC组，而两组MUT-HMBOX1细胞荧光活性无显著差异。见表4。Western与anti-miR-NC组(1.01±0.01)相比，anti-miR-195-5p组HGC-27细胞中HMBOX1蛋白表达(3.30±0.43)明显升高；与miR-NC组(1.00±0.01)比较，miR-195-5p组HGC-27细胞中HMBOX1蛋白表达(0.21±0.02)显著降低(均P<0.05)。见图4。

图3 miR-195-5p与HMBOX1的靶向结合位点

表4 双荧光素酶报告基因检测实验结果

1～4：anti-miR-NC组、anti-miR-195-5p组、miR-NC组、miR-195-5p组图4 Western印迹检测HMBOX1蛋白表达

2.5敲减HMBOX1对胃癌细胞HGC-27增殖、迁移、侵袭与凋亡的影响 与si-NC组比较，si-HMBOX1组胃癌HGC-27细胞中HMBOX1表达显著降低，细胞增殖、细胞迁移和侵袭量均明显降低，细胞凋亡率显著增加及survivin、MMP2、MMP9和Bcl-2蛋白表达明显减少，P21和Bax蛋白表达显著增加(均P<0.05)。见表5，表6，图5。

表5 敲减HMBOX1对HGC-27细胞增殖迁移侵袭及凋亡的影响

表6 各组相关蛋白表达比较

图5 敲减HMBOX1对HGC-27细胞中相关蛋白表达的影响

2.6过表达HMBOX1逆转了miR-195-5p对胃癌细胞HGC-27增殖、迁移、侵袭与凋亡的影响 与miR-195-5p组比较，miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1组HGC-27细胞中HMBOX1表达明显升高，细胞增殖、细胞迁移和侵袭量均显著增加，细胞凋亡率明显降低，且survivin、MMP2、MMP9和Bcl-2蛋白表达均显著升高，P21和Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图6，表7、表8。

1～3：miR-195-5p组、miR-195-5p+pcDNA组、miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1组图6 过表达HMBOX1和miR-195-5p的HGC-27细胞中相关蛋白表达

表7 过表达HMBOX1逆转miR-195-5p对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

表8 各组胃癌细胞相关蛋白表达比较

3 讨 论

miRNA在人类癌症中的致癌或抑癌作用得到普遍认可。miRNA可通过抑制信使RNA的转录或蛋白翻译而发挥调控癌症进展的作用，但是其调控网络极其复杂〔6〕。每个miRNA都可调控多个靶基因，而一个靶基因又可同时被多个miRNA调控〔7〕，这在一定程度上增加了miRNA作用机制研究的难度，也为miRNA在癌症中的治疗提供了难度。Wang等〔8〕发现，miR-195-5p在胃癌细胞中的表达水平下调，且与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达水平呈负相关，miR-195-5p通过下调bFGF，抑制胃癌细胞的迁移和侵袭及异种移植小鼠模型中的肿瘤生长，这可以通过重新引入bFGF来恢复，揭示miR-195-5p通过抑制bFGF抑制胃癌的肿瘤生长，提示miR-195-5p和bFGF可作为胃癌治疗的潜在靶点。Wang等〔9〕研究发现，miR-195-5p通过靶向三部分基序(TRIM)14基因，并调控蛋白激酶B(AKT)信号通路，从而在胃癌细胞中的上皮间质化及迁移侵袭过程发挥作用。本实验结果发现，miR-195-5p表达明显下调。过表达miR-195-5p对胃癌细胞HGC-27的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用，这均与前人报道〔8，9〕相一致；此外，过表达miR-195-5p对胃癌细胞凋亡显示出促进作用，这是国内外首次报道，为miR-195-5p在胃癌中的功能探索提供更充分的理论依据。进一步的，生物信息学预测、双荧光素酶报告基因检测实验研究表明，miR-195-5p靶向并负调控HMBOX1的表达，这也是首次发现在胃癌中miR-195-5p可靶向HMBOX1，推测这与miR-195-5p的作用机制关系密切。

HMBOX1在人类的多种癌症中均出现异常表达，如在高浆液性卵巢癌中低表达并促进癌细胞增殖〔10〕，在肝癌中通过促进自噬、抑制免疫逃避发挥抑肝癌作用〔11〕。Diao等〔12〕在胃癌的研究中报道，HMBOX1在胃癌组织和细胞系中的表达异常上调，并与胃癌患者的TNM分期、淋巴结转移和总生存期相关， HMBOX1在胃癌细胞中的过表达通过加速细胞周期、诱导细胞迁移来增强细胞增殖，相反，沉默HMBOX1抑制了这些作用，此外，该研究还发现CD133的表达与胃癌组织中的HMBOX1呈显著正相关，HMBOX1和CD133的共表达与胃癌患者预后不良显著相关，特别是对于Ⅲ和Ⅳ期患者，揭示了HMBOX1在胃癌中上调并与胃癌细胞增殖和迁移的相关性，提示，HMBOX1联合CD133可能有助于预测晚期胃癌患者的生存。谷军保等〔13〕报道，在胃癌细胞中，HMBOX1的表达水平受miR-221的靶向负调控，进而参与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的调控及裸鼠成瘤的生长。本实验结果与Diao等〔12〕、谷军保等〔13〕实验结果相一致；深入研究发现，过表达HMBOX1后，miR-195-5p抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用及促进细胞凋亡的作用被逆转，这即说明miR-195-5p可靶向调控HMBOX1，更说明了HMBOX1也可逆向调控miR-195-5p的表达及功能。