尹 娟 胡 彤 徐丽娟 张丽平 叶玉兰 庞 智1,&

南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院北区 消化系疾病与营养研究中心1(215008) 消化内科2

背景：克罗恩病(CD)的发病机制目前尚不明确，研究表明肠道微生物在其中起重要作用。目的：研究苏州地区CD患者粪便真菌菌群结构变化及其与疾病间的关联。方法：纳入苏州地区初发CD患者23例和健康对照者18例，采集粪便样本提取基因组DNA，PCR扩增ITS1片段构建克隆文库，HiSeq平台测序，基于OTU行样本物种多样性分析和组间物种差异分析，并进一步分析在CD患者中丰度上调的真菌与炎性指标CRP、ESR、粪便钙卫蛋白和CD活动指数(CDAI)的相关性。结果：CD患者粪便样本中的真菌物种多样性显著小于健康人。从门、纲、目、科、属、种各水平分析，CD患者粪便中丰度显著上调的真菌为酵母纲(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、位置未定科(Incertae_sedis)、念珠菌属(Candida)、白念珠菌(Candida albicans)，新增真菌为丝孢酵母目(Trichosporonales)、丝孢酵母科(Trichosporonaceae)，丰度显著下调的真菌为节担菌纲(Wallemiomycetes)，缺失真菌为球囊菌门(Glomeromycota)、球囊菌纲(Glomeromycetes)、球囊霉科(Glomeraceae)、路德酵母属(Lodderomyces)、中间念珠菌(Candida intermedia)、念珠菌(Candida sp)。CD患者粪便白念珠菌丰度与粪便钙卫蛋白呈显著正相关(r=0.557,P=0.031)。结论：CD患者肠道真菌菌群与健康人相比发生显著结构变化，真菌物种多样性减小，条件致病真菌如白念珠菌丰度增加，可能参与了疾病进程。

克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的常见类型之一，其发病机制目前尚不明确。既往研究表明，肠道微生物(包括细菌、真菌和病毒)在IBD发病中起重要作用[1-9]。随着16S宏基因组测序的二代测序技术在肠道微生态研究中的普遍应用，近年对IBD肠道菌群的研究日益深入。因真菌培养和针对真菌内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)测序存在技术难点以及数据库不完善，目前国、内外分析CD患者肠道真菌菌群谱的研究报道较少[8]。且因地域、采样和研究方法不同，不同研究间结果存在较大差异[9]。Ott等[10]和Li等[11]的研究表明CD患者肠黏膜组织和粪便样本中的真菌多样性增加，Hoarau等[12]发现CD患者粪便样本中的真菌多样性降低，Sokol等[13]和Liguori等[14]分别对CD患者的粪便样本和肠黏膜组织进行研究，发现其真菌多样性与健康对照者相比无明显变化。现有文献报道中，CD患者存在丰度差异的真菌种类也不尽一致，如在粪便样本中，Li等[11]发现白念珠菌(C.albicans)、新型隐球菌(C.neoformans)增加，Hoarau等[12]等发现热带念珠菌(C.tropicalis)增加，Sokol等[13]发现白念珠菌增加、酿酒酵母(S.cerevisiae)减少。为此，本研究收集江苏省苏州地区初发CD患者的粪便样本行ITS1测序分析，探讨该地区CD患者真菌菌群结构变化及其与疾病间的关联。

材料与方法

一、临床样本采集

2018年5月—2019年8月苏州市立医院北区消化内科初发CD患者23例和健康体检者18例纳入研究。入选者均无慢性疾病，就诊前1个月内无用药记录。CD患者诊断符合我国IBD诊治共识，剔除急性肠炎和肠易激综合征。于排便后1 h内采集粪便样本5 g，按0.2 g/份进行分装，过液氮后-80 ℃冰箱保存。研究方案经南京医科大学伦理委员会审核批准[南医大伦审(2017)277号]，并取得所有受检者的知情同意。

二、真菌特异性ITS1区克隆文库构建和测序分析

使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)抽提粪便样本基因组DNA，取质量合格的样品30 ng和ITS1区对应的融合引物配置PCR反应体系，设置反应参数，行PCR扩增。使用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒(Beckman Coulter)对扩增产物进行纯化并溶于洗脱缓冲液中，贴上标签，完成建库。使用生物芯片分析系统(Agilent 2100 Bioanalyzer)检测文库片段范围和浓度，经检测合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq测序平台进行测序。本步骤中的粪便样本基因组DNA提取和HiSeq测序由武汉华大医学检验所有限公司完成。

三、统计学分析

1.多样性分析：使用Mothur软件分析样品alpha多样性。

2.聚类分析：使用phytools软件和R语言(v3.5.1)，根据Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距离矩阵做UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚类分析。对OTU(operational taxonomic unit)进行物种分类，使用R语言(v3.5.1)在种水平对各样品作物种丰度柱状图(丰度在所有样品中均低于0.5%的物种合并为others)。将聚类结果与各样品物种相对丰度整合，直观展示样品的物种组成及其差异情况。

3.差异分析：使用R语言(v3.1.1)Venn-Diagram包绘制OTU Venn图；使用R语言(v3.2.1)mixOmics包绘制OTU PLS-DA(partial least squares discrimination analysis)图；使用R语言(v3.4.1)绘制两组Top 10丰度OTU差异比较柱状图；使用R语言(v3.4.1)行Wilcoxon秩和检验，分析组间物种丰度差异，计算P值和FDA(false discovery rate)值。

4.相关性分析：使用GraphPad Prism软件分析CD组丰度差异真菌白念珠菌的测序丰度与C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、粪便钙卫蛋白(calprotectin,CALP)和CD活动指数(CDAI)之间的相关性。

结 果

一、一般资料

苏州地区23例初发CD患者的CDAI均值为175.2，两组受检者具体临床信息见表1。

表1 CD患者和健康对照者临床信息

二、CD患者粪便样本中真菌物种多样性(species diversity)小于健康对照者

对23例初发CD患者和18例健康对照者粪便样本基因组DNA真菌特异性ITS1区进行建库测序，质控OTU累积曲线末端上升趋势趋于平缓，表明采样量足够，统计数据具有代表性。对两组中能与OTU代表序列比对且OTU具有注释结果的tags总数进行统计分析，结果显示CD组tags总数(真菌总量)均值高于健康对照组，但差异无统计学意义(41 103对33 382,P=0.151 4)。

分析两组单个样品中的物种多样性，shannon指数(P=0.004 7)和simpson指数(P=0.004 3)差异有统计学意义，表明CD组粪便样本中的真菌物种多样性显著小于健康对照组；两组Good coverage值均接近1，表明样品中序列未被测出的概率低(图1、表2)。

由下至上5条线分别为最小值、下四分位数、中位数、上四分位数和最大值，异常值以“•”表示图1 CD患者和健康对照者粪便样本单个样品真菌物种多样性分析(alpha多样性箱型图)

表2 CD患者和健康对照者粪便样本真菌物种多样性alpha多样性指数比较

对粪便样本真菌种水平的UPGMA聚类分析和丰度分析直观展示了所有测序样品的真菌物种组成及其差异情况，结果同样表明CD组真菌物种多样性更低，且在聚类图中部有聚集(图2)。

左图为UPGMA聚类树结果，右图为物种丰度柱状图样品越靠近，枝长越短，表明两个样品的物种组成越相似图2 UPGMA聚类树与丰度组合图

三、CD患者粪便样本差异真菌分析

OTU Venn图结果显示CD组粪便样本中真菌OTU数目小于健康对照组(122对149)，共有OTU数为57个。OTU PLS-DA分析结果表明根据OTU丰度差异可将CD患者和健康对照者区分为两群(图3A)。Top10丰度OTU差异比较柱状图表明两组丰度前10的OTU中有两个(OTU15和OTU177)存在显著差异(图3B)，种水平上分别可注释到似平滑念珠菌(C.metapsilosis)和白念珠菌。种水平的物种丰度差异分析发现CD组白念珠菌显著增多，中间念珠菌(C.intermedia)缺失(图4)。

A：OTU PLS-DA图(横、纵坐标轴刻度为相对距离，无实际意义)；B：Top10丰度OTU差异比较柱状图(*两组间比较，P<0.05)图3 CD患者和健康对照者OTU PLS-DA图和Top10丰度OTU差异比较柱状图

左图为两组物种相对丰度柱状图；中间为同一物种在两组中平均相对丰度比值(健康对照/CD)的log2值；右图为Wilcoxon秩和检验P值和FDR值图4 CD患者和健康对照者粪便样本真菌物种丰度差异Wilcox秩和检验结果

从门、纲、目、科、属、种水平综合分析两组间测序丰度存在显著差异的真菌，CD组粪便样本中丰度显著上调的真菌为酵母纲(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、位置未定科(Incertae_sedis)、念珠菌属(Candida)、白念珠菌，新增真菌为丝孢酵母目(Trichosporonales)、丝孢酵母科(Trichosporonaceae)，丰度显著下调的真菌为节担菌纲(Wallemiomycetes)，缺失真菌为球囊菌门(Glo-meromycota)、球囊菌纲(Glomeromycetes)、球囊霉科(Glomeraceae)、路德酵母属(Lodderomyces)、中间念珠菌、念珠菌(Candidasp)(表3)。

表3 CD患者粪便样本丰度差异真菌

四、CD患者粪便样本白念珠菌丰度与CALP呈正相关

相关性分析显示，CD患者粪便样本中丰度显著上调的白念珠菌与CRP、ESR、CDAI无明显相关性，与粪便CALP呈显著正相关(r=0.557 0,P=0.031 0；图5)。

图5 CD患者粪便样本白念珠菌丰度与CRP、ESR、粪便CALP和CDAI的相关性分析

讨 论

人体内的真菌菌群紊乱与平衡呈动态过程，是塑造机体免疫应答的关键环节之一[15]。共生真菌如白念珠菌、酿酒酵母等可能在驯化宿主免疫系统，从而更有效地对抗病原微生物方面起重要作用[16]。CD和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是IBD最常见的两种类型，且发病机制不明。目前国、内外越来越多的研究证据表明真菌在IBD中起有免疫调节作用，人体免疫系统与真菌之间相互作用的改变可能参与了IBD的发病过程。Dectin-1和CARD9分别为真菌β-葡聚糖受体和抗真菌受体的下游基因[15]。Iliev等[17]的研究发现，C型凝集素受体Dectin-1缺失可使小鼠对共生真菌的免疫应答发生改变，从而对化学诱导的结肠炎易感；UC患者的Dectin-1基因多态性与疾病严重程度显著相关。全基因组关联研究发现CARD9 与IBD易感性相关[18-19]。早年研究[20]也发现血清抗酿酒酵母抗体可作为CD诊断的生物学标志物。因此，研究CD患者肠道真菌丰度改变及其与免疫系统的关系，对于探讨CD发病机制具有重要意义。

本研究发现苏州地区初发CD患者粪便样本中的真菌菌群结构与健康对照者相比有显著差异，真菌总量略有升高，但与健康对照者间差异不显著；CD患者粪便真菌物种多样性减小，在门、纲、目、科、属、种各水平均与健康对照者存在显著差异。分析显示CD患者粪便样本中白念珠菌丰度显著增加，与国外多数研究结果一致[11,13]。白念珠菌作为肠道共生真菌，在诱导免疫耐受中发挥重要作用。调节性T细胞(Treg细胞)是维持机体对黏膜部位抗原的抗炎与促炎免疫反应平衡的核心。活动期CD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例低于非活动期CD患者，存在机体免疫抑制功能失调[21]。有研究[22]发现健康人外周血中含有大量针对共生白念珠菌的抗原特异性Treg细胞。据此推测，CD患者肠道中白念珠菌丰度增加，可能导致外周血白念珠菌特异性Treg细胞增加，抑制肠黏膜对白念珠菌的免疫反应。此种抑制作用可能使共生白念珠菌有机会在肠道内进一步增殖，打破肠道真菌菌群结构平衡，使真菌物种多样性降低。继而在CD后期，白念珠菌可能作为条件致病真菌引发真菌感染。目前IBD疾病本身和(或)治疗药物相关真菌感染已成为临床医师关注的热点问题[23]。此外，还需结合CD患者的基因多态性情况进行推测。患者的真菌免疫相关基因如Dectin-1、CARD9等的多态性或突变可致真菌与宿主间的免疫作用异常，使人体不能抑制白念珠菌等条件致病真菌增殖及其诱发的炎症反应。

近期国、内外研究发现中性粒细胞在IBD发生、发展中起有重要作用[24-26]。活动期CD和UC患者肠黏膜组织和外周血CD177+中性粒细胞比例显著高于健康对照者；与CD177-中性粒细胞相比，CD177+中性粒细胞分泌较低水平的促炎细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-17A，同时分泌较高水平的IL-22和转化生长因子-β(TGF-β)，抗菌活性增强[24-25]。中性粒细胞是抵抗真菌感染最主要的固有免疫效应细胞，其抗真菌机制主要包括吞噬真菌、通过呼吸爆发产生活性氧、释放抗菌颗粒以及形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps)[27]。中性粒细胞分泌的CALP亦有抗微生物感染作用。条件致病真菌白念珠菌的菌丝形态与其侵袭组织和引发感染的致病潜能相关，此种菌丝形态可触发中性粒细胞的迁移活性，进而杀伤白念珠菌[28]。本研究进一步分析了白念珠菌与CD患者中性粒细胞之间的相互作用，发现患者粪便样本中的CALP浓度与白念珠菌丰度呈显著正相关。由此推测白念珠菌在CD中可能起促进中性粒细胞炎性反应的作用，如促进CALP分泌。本研究未发现白念珠菌丰度与炎性指标ESR、CRP和反映病情严重程度的CDAI之间存在相关性，可能与样本量较小有关。

综上所述，本研究分析了苏州地区初发CD患者的粪便真菌菌群结构特征，发现患者肠道真菌菌群与健康人相比发生显著结构变化，真菌生物多样性减小，条件致病真菌如白念珠菌丰度增加，可能参与了疾病进程。研究具有一定地域特色，可为CD临床诊疗以及相关机制研究提供参考数据。本研究的局限性主要包括：样本量偏小，可能因采样因素造成统计误差；未设置UC对照组，未能明确特定真菌丰度变化是否为CD特异性。此外，肠道微生态中的细菌与真菌之间存在相互影响，如能对粪便样本同时进行16S测序，对分析细菌与真菌在CD中的相互作用具有重要意义。因此，本课题组后续拟扩大CD患者粪便样本量，同时收集UC、普通肠炎和肠易激综合征患者的粪便样本，同时行ITS和16S测序，从而更深入地研究CD患者肠道真菌菌群在疾病发生、发展中的作用。