胡文军，何怡静，李孝栋

(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

灵芝作为传统中药，具有补气安神、扶正固本、止咳平喘的功效[1]。现代研究表明，灵芝可改善老年免疫功能低下，拮抗氧化应激所致的组织损伤，抑制阿尔茨海默病(AD)的发生和发展[2]，已经被广泛用作中老年人群的养生保健产品。灵芝多糖是灵芝的主要生物活性成分之一[3]，具有广泛的药理活性，有提高机体免疫力、抑制肿瘤、增强机体耐氧能力、抗衰老、抗辐射、降血糖等功效[4-6]。

目前，灵芝的药物制剂主要有孢子粉、胶囊、滴丸、普通片剂等[7-9]，有关灵芝含片的开发研究还比较少。含片是含在口腔内缓缓溶解而发挥局部或全身治疗作用的片剂，在口腔内停留时间长，具有身心愉悦下发挥功效的特点。

硫酸苯酚比色法测定多糖含量的原理是多糖或寡糖被浓硫酸在高温下水解，产生单糖并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在490 nm处测定多糖含量[10]。但硫酸苯酚法实际测试中，有文献[11-12]选择直接冷却操作后测定吸光度，因为加入浓硫酸时产生放热现象，形成的高温溶液，可以使多糖水解进而完成显色反应，更多文献[13-15]则是加热一定时间后再冷却，继而测定吸光度，该方法使多糖在稳定高温下的水解更充分，进而与苯酚再产生显色反应。多糖在加热条件下水解反应式见图1。

图1 多糖在加热条件下水解反应式

本试验拟对加热因素进行考察，研究其对灵芝含片总多糖含量的影响，以期找到测定总多糖的最佳方法，为其质量标准的合理制订提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 UV-9600紫外分光光度计(北京北分瑞利分析仪器)；MS105DU电子天平(梅特勒-托利多仪器)；TDL80-2B离心机(上海安亭科学仪器厂制造)；HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试药 灵芝含片(福建中医药大学中药药剂实验室自制，批号：20180928、20180929、20180930)；苯酚(西陇科学股份有限公司)；硫酸(西陇科学股份有限公司)；葡聚糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；无水乙醇(西陇科学股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 试药的制备

2.1.1 多糖样品的制备 取制备的灵芝含片适量，研细，精密称取7.0 g置于250 mL烧杯中，加入16倍量蒸馏水，浸泡15 min，100 ℃水浴加热30 min，将提取液在3 000 r·min-1离心10 min，取上清液加入乙醇适量配成含乙醇60%的溶液，静置1 h后将溶液分装于离心管中，于3 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液干燥沉淀后得多糖样品156.46 mg。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取2.5 mg葡聚糖对照品置于25 mL容量瓶内，加蒸馏水溶解并定容至刻度。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 分别精密吸取葡聚糖对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于具塞试管内，加水补至2.0 mL，得到系列浓度梯度的对照品溶液。分别精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，缓慢精密加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，直接冷却，以蒸馏水同步操作作为空白参比，在490 nm处测定吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立线性方程，其线性方程为Y=0.014 6X-0.016 7，r=0.997 8。再按以上步骤进行操作，直接冷却改为沸水浴加热后冷却，其线性方程为Y=0.013 8X-0.033 5，r=0.997 7，结果表明，对照品溶液在15～50 μg·mL-1浓度范围内，线性关系良好(见图2)。

A.直接冷却;B.加热后冷却图2 标准曲线

2.2.2 精密度试验 精密吸取0.7 mL 葡聚糖对照品溶液，加水至2.0 mL，按“2.2.1”项下操作连续测定6次，直接冷却和加热后冷却操作下测得吸光度值的RSD分别为0.10%和0.11%，说明仪器的精密度良好,结果见表1。

表1 精密度试验 (n=6)

2.2.3 重复性试验 精密称取1.0 mg “2.1.1”项下多糖样品6份(批号：20180928)，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得供试品溶液。分别精密吸取0.6 mL，补水至2.0 mL，按照“2.2.1”项下操作测定吸光度值。直接冷却和加热后冷却操作下测得多糖含量的RSD分别为3.21%和2.87%，说明该方法重复性良好，结果见表2。

表2 重复性试验(n=6)

2.2.4 稳定性试验 取“2.2.3”项下制备的供试品溶液，在制备后0、20、40、60、80、100、120 min测定吸光度值，考察其在2 h内的稳定性。直接冷却和加热后冷却操作下测得吸光度值的RSD分别为0.37%和0.27%，说明在两种操作下制备的供试品溶液在2 h内均稳定，结果见表3。

表3 稳定性试验

2.2.5 加样回收率试验 精密称取6份已知含量的多糖样品，分别精密加入等量葡聚糖对照品，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，再分别精密吸取0.6 mL，加水补至2.0 mL，按照“2.2.1”项下操作测定吸光度值，计算加样回收率。经测定，直接冷却和加热后冷却操作下测得的平均加样回收率分别为98.47%和98.32%，RSD分别为2.70%和1.78%，说明该方法回收率较高，结果见表4。

表4 加样回收率试验(n=6)

2.2.6 含量测定 取3批灵芝含片适量，分别按“2.1.1”项下操作，平行制备3份，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分别精密吸取0.6 mL，补水至2.0 mL，按照“2.2.1”项下操作测定吸光度值，代入线性回归方程计算灵芝含片中总多糖含量。测得灵芝含片中总多糖含量见表5。

表5 灵芝含片中总多糖的含量(n=3)

3 讨论

本试验先取一定量的灵芝含片，将其中的多糖提取出来，然后用于方法学考察和含量测定，简化了试验操作步骤，避免了因取样量太少而无法得到沉淀多糖的现象。选取葡聚糖为对照品，是因为灵芝多糖结构主要为β-糖苷键连接的吡喃型葡聚糖[5]。在灵芝含片总多糖的含量测定的方法学考察中，经查阅文献[16-18]，线性关系考察中的浓度大多从“加至2 mL”开始算起，后加的5%苯酚溶液和浓硫酸体积不算在内，所以本试验选择从“加至2 mL”开始计算其浓度并对线性关系进行考察。在试验中要保证操作的一致性，比如进行加热后冷却操作时应保证在沸水浴中同时加热30 min等。