（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011517）

国际上通常将奶牛从分娩到首次适宜输精的时间间隔称为“自愿等待期”（voluntary waiting period，VWP）[1]。不同奶牛之间的最佳VWP不同，37%的奶牛最佳VWP为6周，63%的奶牛最佳VWP小于8周，大约10%的牛VWP大于9周。奶牛产奶需要经过配种、怀孕、分娩等环节。配种技术相对较易掌握，但如何在配种后的等待期及早进行妊娠鉴定，以发现空怀奶牛，及时补配并缩短胎间距，以实现产奶量和利润的最大化则是相对复杂而且十分重要的问题。据统计，每增加一天空怀，饲料成本增加40元以上。按照减少15d的空怀天数来计算，每头牛可节省成本600元。理想的早期妊娠诊断技术应该包括以下特点：①在配种后一个发情周期之内显示出诊断结果；②对于妊娠和未妊娠家畜的诊断准确率在 85%以上；③对母体和胎儿无害；④方法简便、准确实用[2]。近些年早期妊娠诊断方法高速发展，新方法不断涌现，一些曾处于实验发展阶段的方法[3]逐渐成熟。通过检测奶牛血液中妊娠特异性蛋白（PSPB）含量作为判断妊娠标志的方法便是其中之一，该方法在奶牛及相近物种的妊娠检测中具有较高的灵敏度、特异性以及准确性[4]。PSPB来源于胚胎组织，在双核细胞迁移下进入血液循环，有些奶牛在配种后15d开始产生PSPB，所有的奶牛从怀孕后第28天开始都会产生PSPB[5]，一直到整个妊娠周期都在血液中以不同浓度存在，与怀孕天数有着良好的相关性[6]。美国BioTracking公司的BioPRYN早孕诊断试剂盒依据酶联免疫原理可以对怀孕早期奶牛血液中的PSPB进行检测。本研究旨在评价该方法的检测准确性从而丰富牧场怀孕奶牛的早期诊断手段，服务于生产管理，增进牧场收益[7]。

1 材料与方法

1.1 试验动物

配后待检母牛92头，其中呼和浩特蒙德隆牧场26头（配种后30～380d），呼和浩特赛罕牧场66头（配种后17～183d）。

1.2 主要试剂与仪器

BioPRYN牛早孕检测试剂盒，购自美国BioTracking公司。

离心机（型号为5424R），购自德国Eppendorf公司；酶标仪(型号为ELx808IU)，购自美国BioTek公司；20～200mL移液器（型号为Transferpette），8道移液器（型号为Transferpette-8），购自德国BRAND公司；洗板机（型号为ELX508），购自美国BioTek公司；旋涡混合仪（型号为MS3 BASIC），购自德国IKA公司。

1.3 BioPRYN 牛早孕检测试剂盒标准曲线测定

以吸光度值为纵坐标，以PSPB浓度值为横坐标绘制BioPRYN标准曲线。

1.4 BioPRYN 牛早孕检测试剂盒法及触诊法检测奶牛怀孕状况比对

1.4.1 传统直肠检查触摸诊断法检测奶牛怀孕情况

繁殖技术人员通过直肠检查，依据黄体的方位、发育生长态势，子宫角的变化大小，子宫角内压力与波动感的状态，子宫壁柔软程度以及触摸有无胎膜的滑落感来判定奶牛是否受孕[5]。

1.4.2 BioPRYN牛早孕诊断试剂盒检测奶牛怀孕情况

首先利用真空采血管采集母牛血液样本，然后用BioPRYN牛早孕诊断试剂盒进行检测。第一步，加样孵育：用样品缓冲液50μL湿润酶标孔，之后分别添加标准品或样品溶液150μL，用盖板膜密封，盖好微孔盖，在室温20～25℃下孵育4h；第二步，检测反应：孵育结束后，取下盖板膜，用洗涤液冲洗酶标板4次，添加检测溶液室温再次孵育1h；第三步，增强反应：1h孵育结束后再次洗板2次，加入增强试剂（即酶标抗体），于室温孵育1h；第四步，显色反应：增强反应结束后，洗板4次，之后每孔加入TMB底物试剂200μL，室温反应15min；第五步，终止反应：每孔加入100μL终止液；第六步，结果读取：加入终止液后30min内用酶标仪读数，读数波长为650nm。

2 结果与分析

2.1 BioPRYN牛早孕诊断试剂盒标准曲线

图1 BioPRYN试剂盒标准曲线

标准曲线相关系数R2为0.9951，PSPB浓度和吸光度值之间具有良好的线性相关性，见图1。

2.2 触诊结果与试剂盒检测结果比对

表1 92组样本的触诊法及BioPRYN 酶联免疫试剂盒法检测结果

表1数据看出，92组检测结果，两种方法最终得出一致结论的有87组，不一致的有5组，总体符合率为94.6%。其中得出不一致结论的5组奶牛配种天数为26～34d，可能是由于在奶牛配种后一个月左右的初始阶段，PSPB在不同奶牛个体血液中的含量不够稳定，存在差异，处在试剂盒检出限浓度附近，导致结果产生偏差。横向比对配种天数处于35d及以下奶牛试剂盒检测结果的OD值，介于0.045～0.804之间，相对标准偏差RSD为50.9%。

此外，在BioPRYN方法的检测结果中，存在2例Recheck的结果，配种天数分别为27d和30d，占检测总数的1.8%。一般情况下，Recheck的结果均建议7d后重检，数据中Recheck对应的BioPRYN OD值分别为0.150和0.158，在低Recheck的0.135～0.160范围内，因此该结果可看作为较多空怀概率。一周后触诊法复检均为空怀。

BioPRYN方法检测结果中有69例为怀孕，配种天数为26～183d，占比75.0%；21例为空怀，配种天数为34～380d，占比22.1%。两周后用触诊法进行检查，有64例怀孕，占比69.6%，而空怀有28例，占比30.4%。如果以触诊法为标准结果，且试剂盒Recheck检测结果为阴性，则利用BioPRYN方法检测为空怀23例（含Recheck结果），触诊确认均为空怀，先空怀后孕结果的概率为0，即BioPRYN的空怀结论用触诊法100.0%证实，准确率为100.0%，假阳性率为0。利用BioPRYN方法检测怀孕69例，触诊确认怀孕64例，有5例结果不一致，准确率为92.8%，假阴性率为7.2%。

3 讨论

从检测结果分析可知，BioPRYN技术检测未孕奶牛准确率为100.0%，实际应用中可以在母牛配种26d以后，对全体母牛进行BioPRYN检测，如果结果为空怀，可以直接进行配种准备；如果结果为怀孕，则应分为两种情况：①为了避免BioPRYN技术的检测误差，一周后应利用其他孕检方法进行复检，确保结果准确；②奶牛怀孕是一个持续的过程，存在一定的自然流产率。根据美国统计的奶牛数据，30d左右确认怀孕后又在60d左右确认流产的概率为10%～18%。因此可以在母牛配种后42～49d，对已确认怀孕的奶牛中OD值较小的牛只进行复检，根据复检结果进行不同处理。同时与26d的数据进行比较，数据明显变小的牛只需重点查看；在母牛配种60～67d，为了避免10%～18%的“先孕后空怀”的空怀牛只遗漏未查出以致错过配种时间，建议对全体奶牛进行再一次BioPRYN检测。但需根据牧场的实际情况，计算以往的流产比率和再次全体检测的投入费用，以衡量是否再进行全面检查，或用合适的方法进行检查。

综上，BioPRYN技术检测奶牛未孕的准确率可达100.0%，怀孕的准确率可达92.8%。检测简便而快速，可以在早期对奶牛受孕情况进行大通量排查，同时可以配合传统检测方法及时发现流产奶牛[8]，为规模化牧场奶牛配种管理和成本控制提供技术保障。