姜丹 于晶功 孙寒冰

[摘要] 目的 探讨胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）患者胎盘滋养细胞凋亡相关因子P53、bax、bcl-2的表达及意义。 方法 收集2014年3月～2017年6月大连市妇女儿童医疗中心剖宫产分娩患者的胎盘，其中正常妊娠晚期（对照组）、FGR（实验组）各50例。应用免疫组化S-P法检测两组胎盘滋养细胞凋亡相关因子P53、bcl-2、bax的表达。 结果 实验组bax蛋白表达明显高于对照组，差异有显著性（P<0.05），实验组bcl-2蛋白表达低于对照组，差异有显著性（P<0.05）。P53蛋白在正常妊娠晚期、FGR组均未见表达或仅有个别细胞表达，差异无显著性（P>0.05）。 结论 FGR患者胎盘滋养细胞凋亡是非P53依赖的凋亡，凋亡相关因子bax、bcl-2蛋白可能共同介导FGR胎盘滋养细胞的凋亡。

[关键词] FGR;凋亡;P53;bax;bcl-2

[中图分类号] R714.5          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）15-0151-04

Expression of factors P53， bcl-2 and bax related to trophoblast cell apoptosis in FGR placenta

JIANG Dan1   YU Jinggong2   SUN Hanbing2   Liu Yuanyuan1   ZOU Na1

1.Department of Pathology， Dalian Municipal Women and Children's Medical Center， Dalian   116000， China; 2.Department of Pathology， Dalian Maternity Hospital， Dalian   116000， China

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of factors P53， bax and bcl-2 related to trophoblast cell apoptosis in patients with fetal growth restriction（FGR） placenta. Methods Placentas of patients who experienced Cesarean section from March 2014 to June 2017 in Dalian Municipal Women and Children's Medical Center were collected， including 50 cases of normal late pregnancy（the control group） and 50 cases of FGR（the experimental group）. Immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of factors P53， bcl-2 and bax related to trophoblast cell apoptosis in the two groups of placentas. Results The expression of bax protein in the experimental group was obviously higher than that in the control group， and the difference was significant（P<0.05）. The expression of bcl-2 protein in the experimental group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. P53 protein was not expressed in the normal late pregnancy and FGR groups or was only expressed in a few cells， with no significant difference（P>0.05）. Conclusion Apoptosis of placental trophoblast cells in FGR patients is non-P53-dependent apoptosis， and apoptosis-related factors bax and bcl-2 proteins may jointly mediate apoptosis of FGR placental trophoblast cells.

[Key words] FGR; Apoptosis; P53; Bax; Bcl-2

胎兒生长受限（fetal growth restriction，FGR）是产科常见并发症及严重影响围产儿预后甚至死亡的病理妊娠过程，其临床诊断标准为胎儿的出生体重低于同孕龄胎儿平均体重的第十个百分位数或两个标准差。FGR不仅影响胎儿发育，对儿童期、青春期等智力、体能等都有远期潜在影响。FGR的发病原因除外母体营养供应、胎盘转运、胎儿遗传等相对明确的病因外，还有约40%的患者发病病因尚不明确[1]。有文献报道，不明原因的FGR发生与胎盘滋养细胞侵袭不彻底有关[2]，绒毛发育障碍，侵袭过浅，母体则无法通过胎盘供应给胎儿充足的血液及营养。在FGR的发病机制中，有关滋养细胞凋亡异常及凋亡的调控机制被广为关注。在妊娠期的整个过程中均存在着胎盘的滋养细胞凋亡，任何凋亡状态的异常均会引起胎盘滋养细胞的侵袭障碍，导致FGR病理妊娠的发生[3]。本课题组经前期研究发现FGR胎盘滋养细胞存在凋亡增加的现象[4]，现用免疫组化方法检测凋亡相关因子p53、bax、bcl-2的表达与FGR胎盘滋养细胞凋亡的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年3月～2017年6月大连市妇女儿童医疗中心及大连市妇幼保健院住院分娩患者妊娠晚期剖宫产的胎盘，对照组50例，临床诊断为FGR的患者胎盘，实验组50例，对照组与实验组均除外产妇有其他产科或内科等并发症。产妇均无不良嗜好，无特殊疾病感染病史，非试管婴儿，产妇年龄25～33岁，平均（30.3±2.5）岁，孕周35～40周，平均（36.8±2.3）周。所有选取的产妇均为单胎剖宫产，自然受孕，产儿均为活胎，Apgar评分8～10分。两组产妇的年龄、孕周等临床资料差异无统计学意义（P>0.05）。送检胎盘的取材均为临床常规正常送检胎盘，经产妇及家属知情同意。

1.2 主要方法

1.2.1 实验试剂及实验仪器  鼠抗人P53、bax、bcl-2单克隆抗体、DAB染色液、SP免疫组化试剂盒等均购自基因科技（上海）有限公司。全自动组织切片机LeicaRM2255，全自动组织脱水机Thermo_Excelsior_ES，全自动免疫组化仪Roche Benchmark XT，olympus显微镜BX41。

1.2.2 实验方法  送检胎盘，选取胎盘母体面中央区，避开边缘区，出血、钙化、机化、血栓等区取材，0.9%氯化钠注射液冲洗三次，10%福尔马林固定36 h，常规石蜡包埋、组织切片、HE染色、免疫组化SP染色。

免疫组化SP法检测P53、bax、bcl-2蛋白在实验组及对照组胎盘滋养细胞中的表达：参考基因科技P53、bax、bcl-2免疫组织化学检测试剂盒说明书，组织切片按病理学常规脱蜡，水化，抗原热修复，PBS冲洗，过氧化物酶孵育12 min，加一抗，37℃水育60 min，PBS冲洗3次，每次10 min，加二抗37℃水育30 min，PBS冲洗3次，每次10 min，显微镜下根据染色实际情况而定，DAB显色5～10 min终止显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，树胶封片，光学显微镜下观察免疫组化染色表达强度并拍照。

1.2.3 实验结果判定方法  免疫组化半定量结果判读：光学显微镜下采用组织标本滋养细胞的细胞膜或细胞浆中有浅黄色至棕褐色颗粒沉积为阳性的判读标准。每张免疫组化染色切片随机选取15个高倍（×400）视野，按每张切片滋养细胞阳性细胞着色的百分比例以及着色的强度深浅进行半定量分析。阳性细胞着色百分比率记A：<5%，0分;5%～25%，1分;26%～50%，2分;>50%，3分;陽性细胞着色强度记B：无染色或只有淡黄的背景染色，0分;淡黄色细胞膜或细胞浆染色，1分;黄色细胞膜或细胞浆染色，2分;棕褐色细胞膜或细胞浆染色，3分。积分=A×B。积分0分（-）;积分1～3分（+）;积分4～6分（++）;积分7～9分（+++）。每组实验均由两位病理主治以上诊断医生显微镜下判读，最后取检测结果的平均值作为最终的实验结果，根据等级资料的性质进行适合的统计学分析[5-6]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件包进行统计学分析，计量资料采用t检验，等级资料采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 凋亡相关因子P53在胎盘滋养细胞中的表达

P53蛋白主要表达于胎盘滋养细胞细胞核，本实验中P53在对照组与实验组中仅见极少量的斑驳表达或不表达，表达没有显著差异（P>0.05），见表1，封三图11A、11B。

2.2 bax、bcl-2在胎盘滋养细胞中的表达

bax、bcl-2在对照组与实验组中胎盘滋养细胞中均见表达，最主要表达于合体滋养细胞的细胞膜和细胞浆中以及细胞滋养细胞的细胞膜、细胞浆中或表达于蜕膜组织中。实验组中胎盘滋养细胞bax的表达明显高于对照组滋养细胞，差异有统计学意义（P<0.05），见表1、封三图12A、12B。实验组bcl-2蛋白在滋养细胞表达低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1、封三图13A、13B。

3 讨论

FGR是产科常见并发症，其病因多而复杂，目前尚有一部分的FGR病因不明确。FGR不仅会引起严重的围产期并发症，对产妇造成重要影响，从长远的意义看还可能会造成儿童智力的发育及心理健康重大影响。胎盘组织是介于胎儿和产妇之间的物质交换重要器官，胎盘的异常可能导致胎盘血液灌注不足，与之相连的是胎儿无法得到充足的营养供给，引起FGR的发生。随着现代医学的不断进步和发展，从分子学机制对FGR的发生发展有了进一步认识。有研究指出FGR的胎盘中存在凋亡基因[7]。细胞的凋亡是活体组织发生的程序性的细胞死亡，正常病理生理过程及个体成熟发育都必不可少的一种分子生物学现象[8]。本实验组前期研究发现FGR胎盘存在凋亡增加，可能导致胎盘正常功能失衡引起FGR。细胞凋亡是多因素的共同调节使细胞凋亡得以程序性的进行，维持机体的正常功能[9]。影响FGR胎盘凋亡的相关调控因子主要有哪些是本实验的研究重点，这些凋亡因子在FGR胎盘凋亡发生中有什么影响，值得我们进一步深入探讨和研究。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡中起着重要作用，是一类新的癌基因家族[10]，分为二类，其一主要功能是抑制凋亡，代表基因为bcl-2，它的生理功能是抑制细胞凋亡，延长细胞的寿命，而不影响细胞的周期和分化[11]。另一类主要功能为促进细胞凋亡，代表基因为bax，bax可以自身形成同源二聚体或与bcl-2形成异源二聚体，共同参与细胞凋亡，是细胞凋亡的主要结构基础[12]。Bcl-2和bax蛋白在细胞凋亡中的作用相反，通常是以二聚体形式保持一个动态平衡发挥正常作用，当两组蛋白表达失衡，会形成同源二聚体如bax/bax同源二聚体，或bcl-2/bcl-2同源二聚体，bax/bax同源二聚体数量增多导致细胞过度凋亡，影响组织正常生理功能，bcl-2/bcl-2同源二聚体数量增多，抑制细胞凋亡，导致正常凋亡失衡，同样也可以引起组织功能异常。有研究表明，Bcl-2胎盘细胞滋养细胞中低表达，而在合体滋养细胞中高表达，在妊娠的早、中、晚期表达也不一样[13]。在正常妊娠过程中，凋亡持续存在，妊娠早期以抑制细胞凋亡，增加细胞增殖为主，妊娠晚期以细胞凋亡增加为主，在这个过程中凋亡因子发生着变化维持胎盘的动态平衡，参与细胞凋亡的过程。经本课题组研究证实，在正常妊娠晚期（对照组）、FGR患者胎盘（实验组）均可见滋养细胞凋亡，FGR（实验组）滋养细胞凋亡明显增加。Bcl-2和bax蛋白在FGR发生异常凋亡中是否起着一定的作用，如果有作用，它们是如何调控FGR胎盘滋养细胞高凋亡现象是本实验关注的主要问题。