宋 歌，董 彪，朱照伟

1)安阳市人民医院泌尿外科 河南安阳 455000 2)郑州大学第一附属医院泌尿外科 郑州 450052

膀胱癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，是泌尿生殖系统肿瘤致死的第二大原因[1]；近年来，膀胱癌的常规和靶向治疗策略取得了一定进展，但患者的5 a生存率仍较低，且膀胱癌发生发展的机制尚不明确[2-3]。因此，迫切需要开展膀胱癌的分子机制研究，为膀胱癌的诊断和治疗寻找新的生物标志物。微小RNA(microRNA,miR)是一类高度保守的内源性非编码RNA。研究[4]显示，miR参与癌症发生发展进程。miR-130a-3p在多种肿瘤中表达异常[5-6]，miR-130a-3p过表达抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭[7]。细胞外基质蛋白多糖1(Sparc/osteonectin, cwcv, and kazal-like domains proteoglycan 1, SPOCK1)在肿瘤细胞中高表达[8]，下调其表达对肺癌、膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移具有抑制作用[9-10]。本研究拟探讨miR-130a-3p对膀胱癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响以及miR-130a-3p与SPOCK1的靶向关系，以进一步研究其作用机制，为寻找膀胱癌潜在的生物标志物及治疗靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞5637购自美国ATCC公司，DMEM、RPMI 1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自美国应用生物系统公司，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，Lipofectamine 2000购自美国赛默飞世尔有限公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液购自北京索莱宝公司，SPOCK1、β-actin、MMP-2、Caspase-3抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德生物有限公司，Transwell小室、Matrigel基质胶购自美国BD公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司，miR-130a-3p mimics、miR-con、si-SPOCK1、si-con、anti-miR-con和anti-miR-130a-3p购自上海吉玛公司。ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2临床样本收集与细胞培养9例膀胱癌组织及癌旁正常组织来源于安阳市人民医院泌尿外科因膀胱癌接受手术治疗的患者，患者术前未接受过化疗、放疗等治疗，病理学诊断为膀胱癌。癌旁组织距离癌组织≥3 cm。样本切除后立即置于液氮中冻存。

SV-HUC-1细胞加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，5637细胞加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，放入37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养。当细胞生长密度约为80%时，加入适量胰蛋白酶消化，进行传代培养。取处于对数生长期的细胞用于后续实验。以下细胞实验均重复3次。

1.3不同组织和细胞中miR-130a-3p和SPOCK1mRNA表达的检测提取上述组织和细胞总RNA，反转录成cDNA。miR-130a-3p上游引物序列为5’-GATGCTCTCAGTGCAATGTTA-3’，下游引物序列为5’-CTCTGTCTCTCGTCTTGTTGGTAT-3’；SPOCK1上游引物序列为5’-CCCGTTACTGCCGGTGATTA-3’，下游引物序列为5’-CCAGGTCTGGACAAGCTGAG-3’； U6(内参)上游引物序列为5’-ATTGGAACGAT ACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。以合成的cDNA为模板，置实时定量PCR仪进行扩增反应。条件为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min，40个循环后检测扩增曲线和熔解曲线，记录Ct值，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.4不同组织和细胞中SPOCK1蛋白表达的检测采用Western blot法检测。在组织或细胞中加入RIPA裂解液充分裂解，提取总蛋白，加缓冲液置沸水中煮5 min，进行SDS-PAGE，然后将蛋白转移到PVDF膜，常温下用50 g/L 脱脂奶粉溶液封闭1 h，加入SPOCK1一抗(稀释度为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，随后用TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入化学发光液显色、曝光，以目的条带和β-actin条带灰度值的比值为SPOCK1蛋白的相对表达量。

1.5转染miR-130a-3p和沉默SPOCK1对5637细胞生物学行为及MMP-2、Caspase-3表达的影响

1.5.1 细胞分组及转染效率评估 调整5637细胞密度为1×105个/mL，接种于6孔板，待细胞生长至70%融合时开始转染。参照Lipofectamine 2000试剂说明书，将miR-130a-3p mimics(miR-130a-3p组)、miR-con、si-SPOCK1以及si-con转染入5637细胞，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养4～6 h，更换含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养备用。同时设未转染细胞为空白对照组。用qRT-PCR检测空白对照组、miR-130a-3p组和miR-con组细胞中miR-130a-3p的表达(方法同1.3)，用Western blot法检测空白对照组、si-SPOCK1组和si-con组细胞中SPOCK1蛋白的表达(方法同1.4)，以评估转染效率。

1.5.2 细胞存活率检测 收集转染后的5637细胞，用PBS冲洗3次，弃上清液，加入胰蛋白酶消化，之后将细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，每孔加入100 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃摇床孵育10 min，用酶标仪检测490 nm处的吸光度(A)值。细胞存活率=[(待测组A值-调零孔A值)/(空白孔A值-调零孔A值)]×100%。

1.5.3 细胞迁移和侵袭能力的检测 收集转染后的5637细胞，更换为无血清培养基，饥饿处理12 h。将Matrigel胶与无血清培养基充分混合，加入Transwell上室，37 ℃静置3～4 h后将细胞制成5×105个/mL的细胞悬液，吸取100 μL接种于上室，下室加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。37 ℃培养48 h，用无菌棉签擦去多余细胞和Matrigel胶，甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min，显微镜下观察，记录侵袭细胞数。在细胞迁移实验中，Transwell上室不加入Matrigel胶，其余步骤同侵袭实验。

1.5.4 细胞凋亡检测 使用胰蛋白酶消化转染后的5637细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，加入500 μL Annexin V缓冲液重悬细胞，将其转移至EP管，每管加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混合，室温避光孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5.5 MMP-2、Caspase-3蛋白表达的检测 收集转染后的5637细胞，采用Western blot法检测MMP-2、Caspase-3蛋白的表达，具体操作同1.4。MMP-2、Caspase-3一抗均按1∶1 000稀释。

1.6miR-130a-3p与SPOCK1靶向关系的验证运用在线数据库TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)对miR-130a-3p的靶基因进行预测，发现miR-130a-3p和SPOCK1的3’UTR存在部分碱基互补。构建含有miR-130a-3p结合位点的SPOCK1-3’UTR野生型(WT)及突变型(MT)报告基因载体，并分别与miR-130a-3p mimics或miR-con共转染5637细胞，培养48 h后，收集细胞，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书的指示测定荧光素酶活性。进一步将5637细胞分为4组：miR-con组、miR-130a-3p组、anti-miR-con组和anti-miR-130a-3p组，分别转染miR-con、miR-130a-3p mimics、anti-miR-con和anti-miR-130a-3p，方法同1.5。收集4组细胞，采用Western blot法检测SPOCK1蛋白的表达，具体操作同1.4。

1.7统计学处理采用SPSS 22.0处理数据。分别应用配对t检验和两独立样本t检验比较膀胱癌和癌旁正常组织、SV-HUC-1细胞和5637细胞中miR-130a-3p和SPOCK1表达的差异；应用单因素方差分析比较空白对照组、miR-130a-3p组和miR-con组以及空白对照组、si-SPOCK1组和si-con组细胞中miR-130a-3p、细胞存活率、细胞迁移数、细胞侵袭数、凋亡率、MMP-2、Caspase-3、SPOCK1蛋白表达，组间两两比较用SNK-q检验；miR-con组和miR-130a-3p组细胞荧光素酶活性的比较应用两独立样本t检验；4组细胞中SPOCK1蛋白表达的比较应用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同组织及细胞中miR-130a-3p和SPOCK1蛋白的表达结果见表1、2。与癌旁正常组织相比，膀胱癌组织中miR-130a-3p的表达量降低，SPOCK1 mRNA和蛋白表达量升高(P<0.05)。与正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1相比，膀胱癌细胞5637中miR-130a-3p的表达量降低，SPOCK1 mRNA和蛋白表达量升高(P<0.05)，与组织中检测结果一致。

表1 膀胱癌及癌旁正常组织中miR-130a-3p和SPOCK1表达的比较(n=3)

表2 SV-HUC-1和5637细胞中miR-130a-3p和SPOCK1表达的比较(n=3)

2.2转染miR-130a-3p和沉默SPOCK1对5637细胞存活、侵袭、迁移、凋亡及MMP-2、Caspase-3蛋白表达的影响结果见图1，表3、4。5637细胞转染miR-130a-3p mimics后miR-130a-3p的相对表达量升高，说明miR-130a-3p转染成功。与miR-con组比较，miR-130a-3p组细胞存活率、细胞迁移数和侵袭数减少，细胞凋亡率升高，同时MMP-2蛋白表达水平降低，Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。

表3 转染miR-130a-3p对膀胱癌5637细胞存活、侵袭、凋亡及miR-130a-3p、MMP-2、Caspase-3表达的影响(n=3)

转染si-SPOCK1后，5637细胞中SPOCK1表达水平低于si-con组(P<0.05)，表明构建沉默SPOCK1模型成功。与si-con组相比，si-SPOCK1组细胞存活率、细胞迁移数和侵袭数减少，细胞凋亡率升高，同时MMP-2蛋白表达水平降低，Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。

1、4：空白对照组;2:miR-con组;3:miR-130a-3p组;5：si-con组；6：si-SPOCK1组

表4 沉默SPOCK1对膀胱癌5637细胞存活、侵袭、凋亡及SPOCK1、MMP-2、Caspase-3表达的影响(n=3)

2.3miR-130a-3p与SPOCK1靶向关系的验证利用TargetScan对miR-130a-3p的靶基因进行预测(图2A)，发现SPOCK1 3’UTR存在部分碱基可与miR-130a-3p互补配对。表5中双荧光素酶基因报告检测结果显示，miR-130a-3p与野生型(WT)SPOCK1 3’UTR有相互作用。Western blot结果表明，miR-130a-3p组比miR-con组SPOCK1蛋白表达量降低，而anti-miR-130a-3p组较anti-miR-con组SPOCK1蛋白表达量升高(P<0.05)(图2B和表6)。

上：miR-130a-3p和SPOCK1的3’UTR结合位点；下：5637细胞中SPOCK1蛋白的表达；1：miR-con组；2：miR-130a-3p组；3：anti-miR-con组；4：anti-miR-130a-3p组

表5 5637细胞双荧光素酶实验检测结果(n=3)

表6 4组5637细胞中SPOCK1蛋白表达的比较(n=3)

3 讨论

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，在男性和吸烟者中发病率较高[11]，在全世界癌症中排名第9，2012年造成165 000人死亡，新增病例大概有430 000例[12]。目前，虽然手术切除、放疗、化疗等治疗方法逐渐发展起来，但一系列的不良反应、毒性和抗药性等导致膀胱癌的治疗效果仍不理想。因此，深入了解膀胱癌发生发展的机制，寻找有效的监测指标和治疗靶点，对于膀胱癌的临床治疗具有重要意义。

miR是一类约有22个核苷酸长度的非编码RNA，通过与互补信使RNA的特定位点结合来执行转录后的调控作用，降解或抑制miR在许多病理过程中发挥着重要作用[13]。研究[14]表明，miR-130a-3p与癌症发生发展密切相关。在乳腺癌干细胞中，miR-130a-3p表达下调，miR-130a-3p过表达可抑制乳腺癌干细胞增殖、迁移和侵袭[15]。在胃癌组织中，miR-130a-3p显著下调，miR-130a-3p过表达抑制胃癌细胞迁移、侵袭[16]。在鼻咽癌细胞中，miR-130a-3p通过抑制趋化因子CXCL12抑制NPC细胞增殖、迁移和侵袭，从而阻止鼻咽癌进程[17]。本研究中，miR-130a-3p在膀胱癌组织和细胞中低表达，转染miR-130a-3p mimics可抑制膀胱癌细胞存活、迁移侵袭能力和MMP-2蛋白表达，促进细胞凋亡和Caspase-3蛋白表达，说明miR-130a-3p对膀胱癌具有抑癌作用。

SPOCK1是一种蛋白多糖，属于新发现的Ca2+结合蛋白多糖家族，在细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复和转移中发挥着重要作用。研究[18-20]表明，SPOCK1在多种肿瘤中存在高表达现象，能够促进肿瘤细胞的形成、迁移侵袭，抑制细胞凋亡。Li等[21]的研究表明，SPOCK1是miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p共同的靶基因，在肝癌细胞中过表达，miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p通过下调SPOCK1抑制肝癌恶化。miR-150-5p和miR-150-3p直接靶向SPOCK1抑制头颈部鳞状细胞癌细胞的侵袭性[22]。本研究中，SPOCK1 mRNA和蛋白在膀胱癌组织和细胞中高表达，沉默SPOCK1表达可引起膀胱癌5637细胞存活率、细胞迁移侵袭能力下降，细胞凋亡率升高，说明SPOCK1可促进膀胱癌进程，这与吴常文等[8]的报道一致。此外，沉默SPOCK1表达还会影响MMP-2和Caspase-3蛋白表达。

分析miR-130a-3p和SPOCK1的靶向关系发现，SPOCK1可能是miR-130a-3p的靶基因。进一步的分析发现，膀胱癌5637细胞中上调或下调miR-130a-3p表达可调控SPOCK1蛋白水平，miR-130a-3p对SPOCK1的表达具有负性调控作用，SPOCK1是miR-130a-3p的功能性靶基因。

综上所述，miR-130a-3p可能通过靶向调控SPOCK1的表达来抑制膀胱癌细胞存活、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，这为膀胱癌的临床治疗提供了新思路。