王亦如， 杨梦莹， 阳志军△

1广西医科大学肿瘤医院妇科，南宁 5300212广西医科大学区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，南宁 530021

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是常见的妇科恶性肿瘤，其结局取决于早期诊断和治疗，然而卵巢癌起病隐匿、疾病进展较快，影响患者预后。卵巢癌的一线疗法基于肿瘤细胞减灭术和铂类药物化疗，而高复发率和铂耐药是当前面临的临床难题，贝伐单抗和PARP抑制剂的有效应用进一步提示靶向精准治疗的必要性[1-2]。近年来，信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在炎症和肿瘤[3]、肿瘤微环境[4]、肿瘤细胞凋亡抑制[5]等生物学过程中的作用得到印证，STAT3靶向抑制剂WP1066[6]、S3I-201[7]在减缓肿瘤进展和增强化疗药物敏感性中的作用取得初步进展，但其机制和精准靶点有待进一步探索。维甲酸-干扰素诱导死亡相关基因19(the genes-associated with retinoid-interferon induced mortality-19，Grim19)，又名Ⅰ型辅酶脱氢酶1α亚复合物13(NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 13，NDUFA13)，一方面作为线粒体复合体Ⅰ的辅助亚基参与线粒体代谢，同时特异地与STAT3相互作用影响肿瘤进展[8]，是可能的肿瘤治疗靶点，但其作用机制并不明确。本研究旨在通过生物信息学分析，结合卵巢癌临床资料和完整基因芯片信息筛选STAT3、Grim19的相关基因，并富集相关基因，挖掘STAT3、Grim19的临床价值与潜在的功能、机制，为进一步研究二者在卵巢癌疾病中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 STAT3、Grim19生物信息学分析

1.1.1 获取STAT3、Grim19的基本信息 利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UCSC(http：//genome.ucsc.edu/)、UniProt(https：//www.uniprot.org/)等在线数据库，检索STAT3、Grim19的序列号、染色体定位等基本信息。

1.1.2 PubMed检索STAT3、Grim19相关文献 在PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)数据库中查找已发表相关文献，分别以STAT3、Grim19作为关键词检索，仔细阅读并筛选与STAT3、Grim19相关的研究文献。

1.1.3 GEPIA在线工具分析TCGA数据库卵巢癌临床病例中STAT3、Grim19蛋白之间相关性 利用GEPIA软件(http：//gepia2.cancer-pku.cn/)检索TCGA数据库426例卵巢癌的资料信息，采用Pearson检验分析STAT3、Grim19在卵巢癌中表达的相关性，检验标准为P<0.05[9]。

1.1.4 临床病例数据来源及生存分析 使用LinkedOmics在线软件(http：//www.linkedomics.org/login.php/)[10]下载卵巢癌mRNA的TCGA数据集，筛选出包含STAT3表达量的临床病例294例，按照STAT3表达水平由高到低排列，将表达水平位于前50%的病例作为高表达组(n=147)，后50%作为低表达组(n=147)，应用SPSS 26绘制Kaplan-Meier生存曲线；筛选包含Grim19表达量的临床病例549例，将表达水平前50%病例作为高表达组(n=275)，后50%作为低表达组(n=274)，应用SPSS 26绘制绘制Kaplan-Meier生存曲线，检验标准为P<0.05。

1.1.5 STAT3、Grim19相关基因筛选 使用LinkedOmics在线工具(http：//www.linkedomics.org/login.php)下载包含STAT3、Grim19表达水平的基因芯片卵巢癌数据集，共检测基因6426个，使用Spearman相关分析进行筛选，检验标准为P<0.05，利用LinkedOmics在线软件分别选取正负相关基因各50个，绘制火山图[10]。

1.1.6 STAT3、Grim19的GO分析和KEGG分析将筛选出与STAT3、Grim19相关的基因，按照相关系数绝对值排列，取与STAT3关系最强基因136个，与Grim19关系最强基因124个，转换基因名称，利用Omicshare(https：//www.omicshare.com/tools/)在线软件，进行GO(Gene Ontology)功能注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析，选取标准为P<0.05。

1.2 免疫组化法检测STAT3、Grim19表达水平及预后分析

收集2013年1月～2017年12月在广西医科大学附属肿瘤医院经手术治疗的上皮性卵巢癌患者组织标本115例，患者平均年龄为(55.44±1.02)岁。所有患者经术中冰冻切片及术后病理确诊为上皮性卵巢癌，WHO组织学分型以浆液性囊腺癌为主，FIGO分期为Ⅰ～Ⅳ期，治疗方式分为PDS+化疗和NACT+IDS。所取标本均经病理学确诊且拥有完整病历资料，并获患者知情同意及获广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。免疫组化试剂盒购于CST公司(美国)，STAT3、Grim19抗体购于Abcam公司(英国)，按照免疫组化试剂盒操作流程测定STAT3、Grim19在上皮性卵巢癌中的表达，采用Image J进行定量分析，采用SPSS 26进行生存分析，生存曲线采用Kaplan-Meier分析法，使用Log-rank检验进行比较，采用Cox模型进行多变量分析，判定影响预后的独立危险因素，选取标准为P<0.05。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26进行统计学分析，相关性分析采用Pearson检验、Spearman检验；生存曲线采用Kaplan-Meier分析法，多变量分析采用Cox模型，选取标准为P<0.05。

2 结果

2.1 STAT3、Grim19的生物信息学分析结果

2.1.1 STAT3、Grim19的基本信息 通过检索NCBI、UCSC、UniProt等在线数据库，发现STAT3序列号为NC_000017.11，定位于染色体17q21.2区域中的一个簇内，其成熟基因位点在Chr17：42，313，324-42，388，502；Grim19又称NDUFA13，序列号为NC_000019.10，定位于染色体19p13.11区域中的一个簇内，其成熟基因位点在Chr19：19，516，225-19，528，198(表1)。

表1 STAT3、Grim19的基本信息Table 1 Basic information of STAT3 and Grim19

2.1.2 STAT3及Grim19参与的疾病调控 通过PubMed检索STAT3、Grim19相关文献[11-50]发现：STAT3的表达具有组织特异性，STAT3在乳腺癌[11-12]、宫颈癌[13-14]、肺癌[15-16]、卵巢癌[17-18]、胃癌[19-20]、头颈部鳞状细胞癌[21-22]、前列腺癌[23，47]、结直肠癌[24-25]、膀胱癌[26-27]、神经胶质细胞瘤[28-30]、阿尔茨海默病[31]、慢性淋巴细胞白血病[32]等疾病中表达上调，经由JAK/STAT3、IL-6/STAT3、PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、NF-κB/Bcl-2等信号通路参与细胞凋亡、迁移、增殖、侵袭、肿瘤转移、耐药、肿瘤干细胞生成、炎症反应、肿瘤微环境、上皮-间质转化(EMT)等多种生物学过程，见表2。Grim19在乳腺癌[33]、宫颈癌[34]、肺癌[35]、肝癌[36-37]、膀胱癌[38]、肾癌[39]、结直肠癌[40]、甲状腺癌[41-42]、皮肤鳞状细胞癌[43]、子宫腺肌症[44]、原因不明反复流产[45]、弱精子症[46]等疾病中表达下调，主要与STAT3相互作用参与细胞凋亡、迁移、增殖、侵袭、肿瘤转移、耐药等生物学过程，见表3。

表2 Pubmed检索STAT3参与调控的疾病与相关信息Table 2 Diseases regulated by STATS signaling pathway from PubMed searches

表3 Pubmed检索Grim19参与调控的疾病与相关信息Table 3 Diseases regulated by Grim19 signaling pathway from PubMed searches

2.1.3 STAT3、Grim19蛋白表达的相关性分析 利用GEIPA在线工具分析TCGA数据库426例卵巢癌临床病例，结果显示STAT3、Grim19蛋白表达在卵巢癌中存在负相关关系，即Grim19随着STAT3表达的升高而降低，r=-0.29，P<0.05(图1)。

图1 STAT3、Grim19表达的相关性分析Fig.1 The correlation analysis of expression of STAT3 and Grim19

2.1.4 基于TCGA数据库分析STAT3、Grim19表达水平对临床病例预后的影响 基于TCGA数据库的数据分析显示：在294例卵巢癌患者中，STAT3高表达组的中位生存时间与低表达组无明显差异(P>0.05)；在549例卵巢癌患者中，Grim19高表达组的中位生存时间大于低表达组(P<0.05)，Grim19表达水平对患者的预后有影响(图2)。

2.1.5 STAT3、Grim19相关基因筛选结果 在294例表达STAT3的基因芯片临床数据集中，2785个基因与STAT3具有相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。与STAT3呈正、负相关的基因中相关系数较高的50个基因依次为DNAAF2、SLC34A2、FAM134C、UNQ6490、TOM1等，其中与STAT3相关性系数最高(rs=-0.42，P<0.05)的基因为装配因子2(the dynein axonemal assembly factor 2，DNAAF2)，又名C14orf104，是一种蛋白激酶，参与轴突动力蛋白装配，在纤毛和鞭毛运动中起核心作用。在594例表达Grim19的基因芯片数据集中，4960个基因与Grim19具有相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。与Grim19呈正、负相关的基因中相关系数较高的50个基因依次为NDUFB7、MRPL34、C19orf14、MGC3194、P117等，其中与Grim19相关性系数最高(rs=0.75，P<0.01)的基因为NADH脱氢酶1β复合体亚基7(NADH：ubiquinone oxidoreductase subunit B7，NDUFB7)，NDUFB7是线粒体复合体Ⅰ的辅助亚基，在线粒体氧化呼吸链电子传递中起重要作用(图3)。

A：STAT3高表达组与低表达组对患者远期生存的影响；B：Grim19高表达组与低表达组对患者远期生存的影响图2 TCGA临床病例STAT3、Grim19表达水平对患者预后的影响Fig.2 Effect of expression levels of STAT3 and Grim19 on the prognosis based on TCGA database

A：STAT3相关基因火山图；B：Grim19相关基因火山图图3 STAT3、Grim19的相关基因火山图Fig.3 The related gene heatmaps of STAT3 and Grim19

2.1.6 STAT3、Grim19的GO分析和KEGG分析GO功能注释富集分析结果显示，STAT3主要涉及的生物学学过程(biological process)为细胞过程、单一生物过程、代谢过程、刺激反应等；主要涉及的分子功能(molecular function)为结合、催化活性、信号转导活性等；主要涉及的细胞组分(cellular component)为细胞质、细胞膜和细胞器等。Grim19主要涉及的生物学过程为细胞过程、代谢过程、细胞组分组织或合成等；主要涉及的分子功能为结合、催化活性、结构分子活性等；主要涉及的细胞组分为细胞质和细胞器等(图4)。

KEGG信号通路富集分析结果显示，STAT3信号通路主要参与的细胞过程为运输和分解代谢，作用的机体系统为免疫系统和内分泌系统，涉及信号转导，在传染病和恶性肿瘤中作用明显；KEGG信号通路富集发现STAT3主要作用在肌动蛋白细胞骨架的调节、补体途径、白细胞跨内皮迁移等信号通路中。Grim19信号通路在神经退行性疾病、内分泌和新陈代谢疾病、恶性肿瘤中作用明显，参与多种生物代谢过程，如能量代谢、核苷酸代谢等，作用的机体系统多为环境适应和神经系统，在遗传信息处理中发挥重要作用；KEGG信号通路富集发现Grim19主要作用在亨廷顿病、氧化磷酸化、帕金森综合征、非酒精性脂肪肝病等信号通路中(图5)。

A：STAT3相关基因GO功能注释中关联性最强的20个功能；B：Grim19相关基因GO功能注释中关联性最强的20个功能图4 STAT3、Grim19相关基因GO功能注释Fig.4 The GO term of STAT3 and Grim19 genes

2.2 免疫组化法检测临床样本中STAT3、Grim19的表达水平及预后分析

将免疫组化测得的115例上皮性卵巢癌样本STAT3、Grim19表达水平按照从低到高排列，位于前50%的患者为低表达组(58例)，余为高表达组(57例)。低表达组平均STAT3水平为(56.20±9.65)，高表达组为(78.85±6.15)；平均Grim19表达水平，低表达组为(8.37±3.23)，高表达组为(18.88±3.97)。STAT3、Grim19高表达组的中位生存时间与低表达组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见图6。

A：STAT3表达水平对患者远期生存的影响；B：Grim19表达水平对患者远期生存的影响图6 115例上皮性卵巢癌患者STAT3、Grim19表达水平对患者远期生存的影响Fig.6 Effect of STAT3 and Grim19 expression levels on overall survival rate of 115 patients with epithelial ovarian cancer

采用Cox比例风险模型分析115例上皮性卵巢癌组织标本STAT3、Grim19的表达水平及临床病理参数(年龄、FIGO分期、WHO组织学分型、治疗方式)与预后之间的相关性，以评估影响上皮性卵巢癌患者预后的独立危险因素。结果表明，年龄可能是影响预后的独立危险因素，P<0.05，HR=0.348，95%可信区间为(0.171，0.706)。

3 讨论

恶性肿瘤的发生、发展及对患者预后的影响与细胞内异常的信号转导紧密相关，而与炎症反应、肿瘤细胞凋亡的抑制、肿瘤微环境等生物过程相关的信号通路是影响肿瘤进展的关键环节，不同信号通路交织成网，受多种靶点影响[51-52]。STAT3作为多种信号转导通路的关键环节调控着机体的生物学过程，本研究通过对PubMed数据库检索发现，STAT3在乳腺癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌等恶性肿瘤中普遍上调，经由JAK/STAT3信号通路过度激活，形成磷酸二聚体转入核内对靶基因进行调节，发挥肿瘤细胞凋亡抑制作用[53]。STAT3经由IL-6/STAT3、PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、NF-κB/Bcl-2等信号通路影响恶性肿瘤的进展，参与迁移、增殖、侵袭、肿瘤转移、耐药、肿瘤干细胞生成、炎症反应、肿瘤微环境、上皮-间质转化(EMT)等多种生物学过程。靶向STAT3的抑制剂在延缓肿瘤进程和增强化疗敏感性中作用的部分发现为进一步探索STAT3在临床治疗上的应用提供了依据[54]。

Grim19(NDUFA13)是一种新型的癌症抑制基因，参与线粒体氧化代谢并特异性作用于STAT3[8，55]。本课题组前期研究发现，Grim19在上皮性卵巢癌中表达明显低于对照卵巢组织，STAT3在上皮性卵巢癌中表达明显高于对照卵巢组织，且二者呈负相关。本研究采用GEPIA在线分析工具分析所得的STAT3、Grim19在卵巢浆液性囊腺癌临床病例中的表达呈负相关的结果与之一致，进一步证实STAT3、Grim19之间的特异性互作关系。同时，本研究检索PubMed数据库显示，Grim19在乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中特异性低表达，主要经由Grim19/STAT3信号通路参与肿瘤细胞凋亡、迁移、增殖、侵袭等生物学过程。

为进一步明确STAT3、Grim19的功能，采用Omicshare在线软件对筛选出的相关基因进行GO功能注释富集分析和KEGG通路富集分析，显示STAT3涉及多种功能如免疫系统过程、生物粘附、细胞粘附、细胞增殖，且STAT3主要位于细胞质中，在细胞膜上也表达，这与其的信号转导机制相符合。Grim19涉及功能最强的为线粒体ATP合成耦合电子输运，这符合其作为线粒体复合物Ⅰ辅助亚基的特性。相关基因的富集分析结果为深入研究STAT3、Grim19的机制奠定了一定理论基础。

基于TCGA数据库研究STAT3、Grim19表达水平对临床病例预后的影响，发现STAT3表达水平对卵巢浆液性囊腺癌的远期生存率无明显影响，而高表达Grim19的患者远期生存率明显优于低表达Grim19的患者，提示Grim19对卵巢癌患者生存的临床价值。研究本院上皮性卵巢癌临床样本中两蛋白表达水平对卵巢癌预后的影响发现，STAT3、Grim19表达水平与患者远期生存率无明显相关，与基于TCGA的研究结果不一致。分析造成TCGA数据库生存分析结果与本课题组研究病例生存分析结果不一致的原因可能为部分病例资料观察时间较短，存在结尾数据较多。

综上所述，在多种恶性肿瘤中存在STAT3、Grim19特异性表达，STAT3表达上调，Grim19表达下调，二者呈负相关，且经由多种信号通路影响恶性肿瘤进展；Grim19经由STAT3调控卵巢疾病进展，有望成为评价卵巢癌预后的指标；STAT3在各种生物过程中的重要作用，为卵巢癌靶向治疗提供了可能。