旷历琼，王 娜

新疆维吾尔自治区人民医院 1.消化科；2.干部保健诊疗中心，新疆 乌鲁木齐 830001

结肠癌在世界范围内普遍存在，并且是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。早期结肠癌缺乏明确且典型的症状，大多数患者诊断时已处于晚期[2]，因此，错过了治疗的最佳时机，预后较差。柚皮苷(4,5,7-三羟基黄烷酮-7-鼠李葡糖苷)是一种天然糖苷，属于生物类黄酮，衍生自葡萄柚和其他柑橘类水果[3]。研究表明，柚皮苷可抑制宫颈癌细胞的生长，且随其浓度增加抑制作用增强，促进细胞凋亡[4]。柚皮苷能显著抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖并诱导其凋亡，降低侵袭能力[5]。Aplasia Ras homolog member I(ARHI)基因在人结肠癌中存在表达下调或缺失，在结肠癌中发挥抑癌基因功能[6]。ARHI在胃癌组织中的表达显著低于正常胃黏膜上皮组织，过表达ARHI诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭，阻滞细胞周期[7]。ARHI基因在卵巢癌中低表达，过表达ARHI基因可以抑制卵巢癌SKOV3细胞生长，使SKOV3细胞阻滞于S期，诱导细胞凋亡[8]。但柚皮苷对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响，且柚皮苷是否通过调控ARHI基因表达影响结肠癌细胞的增殖和凋亡，目前尚未可知。因此，本研究考察了柚皮苷对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响及其相应的分子机制，旨在为柚皮苷治疗结肠癌提供临床前证据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂结肠癌细胞株SW620购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，柚皮苷购自美国Sigma公司，胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，pcDNA-ARHI、pcDNA-ARHI阴性对照pcDNA、si-ARHI、si-ARHI阴性对照si-NC购自上海GenePharma公司，Lipofectamine 2000试剂(货号11668030)、Annexin-V-碘化丙啶(Propudium iodide，PI)凋亡试剂盒(货号88-8005-72)购自美国Invitrogen公司，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)(货号ab226977)、p21(货号ab227443)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)(货号ab196495)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(货号ab53154)、ARHI(货号ab107051)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(货号ab9485)抗体、辣根过氧化物酶偶联的二抗(货号ab205718)购自美国Abcam公司，PrimeScript RT Master Mix试剂盒(货号RR036A)、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(货号RR420A)购自日本TaKaRa公司。

1.2 细胞培养与处理将SW620细胞在含有质量浓度为100 g/L FBS的RPMI-1640培养基中，37 ℃和体积分数为5% CO2的培养箱中培养，并在达到90%汇合时传代。培养细胞至对数生长期，将细胞分为对照组、柚皮苷-低组、柚皮苷-中组、柚皮苷-高组。其中，对照组为正常培养的SW620细胞，柚皮苷低、中、高组分别使用5、10、20 μmol/L浓度[5]的柚皮苷作用于SW620细胞，48 h后收集细胞备用。

1.3 细胞转染与处理根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000将所有寡核苷酸转染到SW620细胞中。转染后，将细胞分为pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-ARHI组(转染pcDNA-ARHI)、对照组(正常培养的SW620细胞)、柚皮苷组(20 μmol/L柚皮苷处理SW620细胞)、柚皮苷+si-NC组(20 μmol/L柚皮苷和转染si-NC的细胞)、柚皮苷+si-ARHI组(20 μmol/L柚皮苷和转染si-ARHI的细胞)，处理48 h后，收集细胞备用。

1.4 MTT检测细胞增殖将SW620细胞接种到96孔板中，每孔3×105个细胞，37 ℃、体积分数为5% CO2条件下孵育48 h，将20 μl MTT试剂添加到每孔中，继续培养4 h。之后加入150 μl二甲基亚砜，摇床震荡培养10 min，置于酶标仪检测450 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞的增殖抑制率(%)。

1.5 免疫印迹实验(Western blotting)检测CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、ARHI蛋白表达SW620细胞中加入放射免疫沉淀缓冲液，提取细胞的蛋白，通过BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。等量的蛋白(30 μg)用质量浓度为100 g/L的SDS-PAGE分离，然后转到聚偏二氟乙烯膜。室温条件下用质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶封闭，2 h后将膜与抗CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、ARHI(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)抗体4 ℃孵育，过夜。然后用辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶5 000)室温孵育2 h。使用增强的化学发光试剂和Image J软件分析蛋白条带。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡将SW620细胞接种到96孔板中，每孔1×106个细胞，经不同的处理后，将细胞轻轻重悬于500 μl Annexin V结合缓冲液中，然后加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，轻轻摇动，室温孵育10 min，通过流式细胞仪分析SW620细胞凋亡。

1.7 实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测ARHI mRNA表达分别用TRIzol溶液提取各组SW620细胞的总RNA。使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒从1 μg总RNA中合成cDNA。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒，在ABI PRISM 7500实时系统中进行。使用的引物序列如下：ARHI：正向5′-GATTACCGCGTCGTGGTAGTC-3′，反向5′-TCAATGGTCGGCAGGTACTCA-3′；GAPDH：正向5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，反向5′-GCTCTTGCTGGGGCTGGTGG-3′。采用公式2-ΔΔCt确定ARHI mRNA水平。

2 结果

2.1 柚皮苷对结肠癌SW620细胞增殖的影响MTT和Western blotting检测结果显示，与对照组比较，柚皮苷-低组、柚皮苷-中组、柚皮苷-高组结肠癌SW620细胞的增殖抑制率显著增加，CyclinD1蛋白水平显著降低，p21蛋白表达量明显升高，均呈浓度依赖性(P<0.05)(见表1、图1)。

表1 柚皮苷对结肠癌SW620细胞增殖的影响

图1 增殖相关蛋白的表达

2.2 柚皮苷对结肠癌SW620细胞凋亡的影响流式细胞术和Western blotting检测结果发现，与对照组比较，柚皮苷-低组、柚皮苷-中组、柚皮苷-高组结肠癌SW620细胞的凋亡率显著增加，Bcl-2蛋白水平显著降低，Bax蛋白表达量显著升高，均呈浓度依赖性(P<0.05)(见图2、表2)。

图2 柚皮苷对结肠癌SW620细胞凋亡的影响 A：凋亡相关蛋白表达；B：细胞凋亡流式图

表2 柚皮苷对结肠癌SW620细胞凋亡的影响

2.3 柚皮苷对结肠癌SW620细胞中ARHI基因表达的影响qRT-PCR和Western blotting检测结果表明，与对照组比较，柚皮苷-低组、柚皮苷-中组、柚皮苷-高组结肠癌SW620细胞中ARHI mRNA和ARHI蛋白表达量明显增加，并呈浓度依赖性(P<0.05)(见图3、表3)。

表3 柚皮苷对结肠癌SW620细胞中ARHI基因表达的影响

图3 ARHI蛋白表达

2.4 ARHI过表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响Western blotting、MTT和流式细胞术检测结果显示，与pcDNA组比较，pcDNA-ARHI组结肠癌SW620细胞的ARHI蛋白表达量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表达量明显增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)(见图4、表4)。

表4 ARHI过表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响

图4 ARHI和增殖、凋亡相关蛋白表达

2.5 抑制ARHI表达逆转了柚皮苷(20 μmol/L)对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用Western blotting、MTT和流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，柚皮苷组结肠癌SW620细胞的ARHI蛋白表达量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表达量明显增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)。与柚皮苷+si-NC组比较，柚皮苷+si-ARHI组结肠癌SW620细胞的ARHI蛋白表达量、抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表达量明显减少，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)(见表5、图5)。

表5 抑制ARHI表达逆转了柚皮苷对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用

图5 ARHI和增殖、凋亡相关蛋白表达

3 讨论

近年来，由于危险因素的变化以及筛查测试和治疗方法的改进，结肠癌患者的发病率和死亡率有所下降，但各个国家和地区的5年生存率差异较大[9]。在中国，结肠癌的发病率逐年增加[10]。目前，化学疗法是最常见的癌症治疗策略，抗癌药的副作用仍是恶性肿瘤化学疗法中的主要问题[11]。因此，仍需寻找新的结肠癌治疗药物，增加患者的治疗选择。本研究评估了不同浓度柚皮苷对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响，结果显示，柚皮苷具有一定抗肿瘤活性，能够有效抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，而调控结肠癌细胞中ARHI的表达可能解释了其抗肿瘤作用。

柚皮苷是从天然植物中提取的类黄酮物质，具有多种有益的药理学性质，如抗癌、抗氧化、抗炎、抗衰老、保护心脑血管、保护药物性肝损伤[12-14]。根据一些体外和体内研究的报道，生长抑制和诱导凋亡是柚皮苷在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌和胃癌等肿瘤进展中的共同作用[15]。Zhou等[16]考察了柚皮苷在甲状腺癌中的抗肿瘤功能，结果表明，柚皮苷以剂量和时间依赖方式抑制甲状腺癌TPC-1和SW1736细胞增殖，而以剂量依赖性诱导TPC-1和SW1736细胞凋亡。此外，柚皮苷剂量依赖性地提高细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)-3和Bax的表达，并降低了CyclinD1和Bcl-2的表达。Cai等[17]报道指出，在0.5～2 mg/kg的范围内，柚皮苷剂量依赖性地抑制卵巢肿瘤的体内生长，且促进卵巢肿瘤细胞的凋亡。另外，柚皮苷显著降低Bcl-2、CyclinD1、c-Myc和survivin的表达，其机制可能与Caspase-7、Caspase-3、Bcl-2等介导的细胞凋亡有关。柚皮苷在乳腺癌细胞MCF7和肺癌细胞A549中表现出明显的细胞毒性[18]，口服柚皮苷可预防AOM/DSS诱导的C57BL/6小鼠溃疡性结直肠炎症和致癌作用，且无明显的副作用，柚皮苷可以开发成为一种有希望的溃疡性结肠炎和结直肠肿瘤的治疗剂[19]。在当前研究中，柚皮苷以浓度依赖方式显著增加SW620细胞的增殖抑制率，以及提高细胞的凋亡率和p21蛋白、Bax蛋白水平，并减少CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表达量，与前述研究[16,19]一致，也为柚皮苷作为结肠癌抑制剂提供了新的证据。

本研究检测到，不同浓度的柚皮苷明显增加SW620细胞中ARHI mRNA和ARHI蛋白表达量，均呈浓度依赖性，提示柚皮苷发挥抗肿瘤活性的机制可能与调控结肠癌中的ARHI基因有关。ARHI基因属于Ras超家族，位于人类1p31.3染色体上，包括1个启动子、2个外显子和1个内含子，带有1个687 bp的蛋白质编码区，可编码26 kD的蛋白质[20]。此前，ARHI基因已被证明是结肠癌[6]、甲状腺癌[21]、胶质母细胞瘤[20]、胰腺癌和肺癌[22]等多种人类癌症的抑癌基因，具有抑制细胞增殖和诱导凋亡作用。与配对的非癌组织相比，结肠癌组织中ARHI mRNA和蛋白表达水平显著降低，ARHI在结肠癌中充当肿瘤抑制因子[23]。本实验同样发现，ARHI过表达显著增加结肠癌SW620细胞的抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表达量，显著降低CyclinD1和Bcl-2蛋白水平，起着抑癌基因的作用。另外，抑制ARHI表达逆转了柚皮苷促进SW620细胞增殖抑制率、凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白表达的作用，和逆转了其抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白表达的作用，这些结果证明，柚皮苷可能通过上调ARHI表达，抑制结肠癌细胞增殖，并促进细胞凋亡。

综上所述，5、10、20 μmol/L浓度的柚皮苷可以抑制结肠癌细胞增殖，以及诱导细胞凋亡，并呈浓度依赖性，其作用机制与调控结肠癌细胞中的ARHI表达有关，这为结肠癌的临床治疗提供了有前景的药物。