王 剑，李 屹，王 实，刘剑辉，刘文艳，宋光熠，郑洪新

（1. 辽宁省基础医学研究所 沈阳 110101；2. 辽宁中医药大学中医学院 沈阳 110847）

随着人口老龄化加速，全球每3 秒就会发生1 例骨质疏松性骨折。 其中绝经后骨质疏松症（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）发病率逐步上升，严重影响绝经后妇女的生活质量。

骨质疏松症是多种原因引起的以全身骨量减少，骨组织微结构破坏，骨强度下降，骨脆性增加为特征的一种代谢性骨病，极易发生骨折。近年研究表明，DNA 甲基化、组蛋白修饰、microRNA 可调控多种成骨、破骨相关基因的表达，从而影响成骨细胞和破骨细胞的分化和活性，参与骨质疏松的发生发展[1]。本研究基于成骨细胞分化、成熟的重要特异性转录因子Runx2、Osterix[2]基因启动子的甲基化修饰，探究我国医学“肾主骨”理论指导下的鹿茸中药复方防治PMOP的表观遗传疗效机理，具有重要的科学意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组、造模

SPF级Wistar3月龄雌性未交配大鼠61只，体质量（240 ± 20）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司（辽宁省实验动物资源中心），许可证号：SCXK（辽）2015-0001。动物购进后，饲养于辽宁省基础医学研究所药理实验室（国家中医药管理局二级实验室），室温20℃～25℃，相对湿度35%～65%，饲喂大小鼠维持饲料（辽宁长生生物技术股份有限公司）。

大鼠适应性喂养4 天后，随机分出正常组12 只，余者进行双侧卵巢切除术：3%戊巴比妥钠腹腔注射（35 mg/kg）麻醉，腹部切口切除双侧卵巢。术后大鼠随机分出模型组12 只、鹿茸中药复方组18 只、仙灵骨葆阳性对照组19只（灌胃期间死亡1只）。

1.2 实验药品及给药剂量与方法

1.2.1 实验药品

鹿茸中药复方：排血马鹿茸冻干粉（辽宁宏宇生物科技有限公司）、淫羊藿颗粒（规格：100 g 颗粒相当于2100 g 饮片，四川新绿色药业科技发展有限公司）、纳米牡蛎壳微粉（平均粒径780 nm，长山岛大连湾）。

仙灵骨葆胶囊：成分为淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄，国药集团同济堂（贵州）制药有限公司，国药准字Z20025337，批号180417。

1.2.2 给药剂量与方法

大鼠等效剂量按成人（体质量60 kg）6.3 倍计算，1 ml/100 g。正常组和模型组给生理盐水；鹿茸中药复方组给鹿茸中药复方（排血马鹿茸冻干粉0.315 g·kg-1·d-1、淫羊藿颗粒0.15 g·kg-1·d-1、纳米牡蛎壳微粉1.05 g·kg-1·d-1）；仙灵骨葆阳性对照组给仙灵骨葆胶囊粉0.315 g·kg-1·d-1。术后6 d开始，每日灌胃1次（每灌6日，休息1日），连续14周。

1.3 主要仪器与试剂

1.3.1 主要仪器

X 射线骨密度测定仪（STRATOS DR，Diagnostic Medical System SA，法国）、PCR 仪（96 孔，BIORAD）、S1000TM Thermal Cycler （384 孔 ，BIORAD） 、MassARRAY Nanodispenser（RS1000，SEQUENOM）等。

1.3.2 主要试剂

QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，51304）、EZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO，D5005）、MassCLEAVE Kit（SEQUENOM，10129.1）、PCR Accessory Set（SEQUENOM，11327）、Spectro CHIP ® Arrays and Clean Resin Kit（SEQUENOM，10117）等。

1.4 指标检测

1.4.1 骨密度（BMD）

取第1～6 腰椎，剔除附着软组织，生理盐水冲洗，用生理盐水浸湿的医用纱布包裹，外包锡纸，写上编号，冻存于-80℃冰箱。应用X 线骨密度仪（STRATOS DR）检测大鼠第1～6腰椎骨密度，精细模式扫描，仪器附带DMS 小动物软件（版本：V4.0.7.1）分析骨密度值，以单位面积骨矿含量（g/cm2）表示。

1.4.2 Runx2、Osterix启动子甲基化水平

取双侧股骨头，剔除附着软组织，生理盐水冲净血污，无菌吸水纸吸干，装入编好号的液氮冻存管，拧紧管盖，液氮速冻0.5 h后，冻存于-80℃冰箱。质谱法检测：①引物设计：检测片段：Runx2 基因启动子-955 bp～-456 bp（序 列：CTTCAAAGTAACCAAGGGATGATGGTAAAAATAATATAAATGATACTAATTACAT TTAATCTTTATTGTAAGAGCTACCACCTAATAAAAA AATCAACTACACAGTCATGATTTAGTATTTGTAAAG GAATCCCCAGGCTAACACTTTTGTGACAGCCAATTA CAGTCAATCCCGGCAAGGAGTTTGCAAGCAGACCTT TGGAAAGGTAAACTGTTTTACAATGAGTTACAGATC TACAAGCTTAGGAAGACAAGCAGGAAAGAAGCAGC CACCCTGGGAAATCCGAAGCAGCCCTGAAAGTGAT ACAATCCCAAGATGTGACCCACTGCGAAGCAGCAGT TGTTCAGAACGCCGCACTCACTTGAAACAGTTTTGC TCACTTTTCCATAGACATAATAATGAAGGAAAGAGA GGAGGGGTAGAGAAAAGAGAAGAAAGAGCAGACG AGGGAAGGAGGGAAGGGGGGAGTAGGGAGGTGG ⁃TAGAAAGGAAAACCCTTAGC），长度500 bp，CpG 位点总数6 个，能检测到5 个CpG 位点。Osterix 基因启动 子-1082 bp～-583 bp（序 列：AGGACCCAC

TGTAGATGGAGGGAACTGACTTCTTTATGTCTTTCTC AGCTCTCCAAATTTGTGCCATGGCATGGGTTCACTG ATCACCCATTCCAATCTCTAGATAGATTCAACTAAA AATTTTAATTTAGATTTTAGTTTGACTAATATAGGGA CATAGTGACTAGTAATGTGTGATAGACTTTAAGAGA TTAACAAGACATTTAGCTACTAATTTAATTTCCAGG GACTCCATCCTTGGATACCTGCAAGTGTCAATGACC TCAGTTTACTTTCTAGTTTTCCAATCTAATGCGGGAT GGAGTTACTCTAAGAATCCATTATTAGAAGGAATTC TACCTTCTCTATAAACTTTTGGGCATGACCTAGTCAA AGTTTTTGGTAAATGGTTTACTCCCACGGTTTCTAGA GCCAATATCAGAAAGAGTCCTGAAGGCTGATCAAGT ACCTCTGGAAAATATTTCCAAAGGGTACGTGCATCT⁃GTTTTCTGGTCCTGGCTC），长度500 bp，CpG 位点总数3 个，均可检测到。使用Sequenom 公司Epidesigner（http://www.epidesigner.com）设计引物，Runx2 修饰后的上游引物：aggaagagagTTTTAAAGTAATTAAGGGAT⁃GATGG，修饰后的下游引物：cagtaatacgactcactatagggaga⁃aggctACTAAAAATTTTCCTTTCTACCACCTC。 Osterix

修饰后的上游引物：aggaagagagTGGTAGGTGGTAGTG⁃TAGGTGTTTT，修饰后的下游引物：cagtaatacgactcac⁃tatagggagaaggctAAAAAAAATCTTCTC-CTCTCTCAAA。引物设计完成后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。②DNA 提取：使用QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）试剂盒提取骨组织DNA。③重亚硫酸盐处理：使用PCR 仪（96 孔，BIORAD）、EZ DNA Methyla⁃tion-Gold Kit（ZYMO）试剂盒对DNA 样品进行重亚硫酸盐处理，使未甲基化的C 转变为U，甲基化的C 不变。④PCR 扩增：使用S1000TM Thermal Cycler（384孔，BIORAD）、PCR Accessory Set（SEQUENOM）试剂盒和步骤①设计、修饰、合成的引物扩增重亚硫酸盐处理后的样品。⑤碱性磷酸酶处理（SAP）：使用S1000TM Thermal Cycler（384 孔，BIORAD）、Mass⁃CLEAVE Kit（SEQUENOM）试剂盒处理步骤④的PCR产物。⑥体外转录(IVT)和RNase 酶切：使用S1000TM Thermal Cycler（384 孔，BIORAD）、MassCLEAVE Kit（SEQUENOM）试剂盒将SAP 处理后的PCR 产物进行体外转录和RNase 酶切。⑦纯化，点样及质谱：使用

Spectro CHIP ® Arrays and Clean Resin Kit（SEQUE⁃NOM）试剂盒。本实验质谱法检测甲基化由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。

1.5 统计分析

应用SPSS 18.0 软件，数据以xˉ±s表示，多组计量资料数据两两组间比较用one-way ANOVA，P＜0.05为差异显著。

表1 各组大鼠离体第1～6腰椎骨密度（-x ± s）

2 结果

2.1 各组第1～6腰椎骨密度比较

由表1 可知，与正常组比较，模型组第1～6 腰椎骨密度明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，鹿茸中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组第1～6 腰椎骨密度明显升高（P＜0.05）；鹿茸中药复方组比仙灵骨葆阳性对照组第1～6 腰椎骨密度有升高趋势，差异不显著（P＞0.05）。

2.2 各组骨组织Runx2、Osterix启动子甲基化水平比较

Runx2 基因启动子检测片段-955 bp～-456 bp 含有CpG 位点6 个，位点6 未检测到；Osterix 基因启动子检测片段-1082 bp～-583 bp 含有CpG 位点3 个，均检测到。

2.2.1 各组骨组织Runx2 启动子-955 bp~-456 bp 甲基化水平比较

由表2 可知，与正常组比较，模型组CpG1、CpG2甲基化水平明显升高（P＜0.05），模型组CpG3、CpG4.5甲基化水平有升高趋势，差异不显著（P＞0.05）。与模型组比较，鹿茸中药复方组CpG1、CpG3甲基化水平明显降低（P＜0.05），鹿茸中药复方组CpG2、CpG4.5甲基化水平有降低趋势，差异不显著（P＞0.05）；仙灵骨葆阳性对照组CpG1、CpG2 甲基化水平明显降低（P＜0.05），仙灵骨葆阳性对照组CpG3、CpG4.5 甲基化水平有降低趋势，差异不显著（P＞0.05）。

2.2.2 各组骨组织Osterix 启动子-1082 bp~-583 bp 甲基化水平比较

由表3 可知，与正常组比较，模型组CpG1、CpG2甲基化水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，鹿茸中药复方组CpG1 甲基化水平明显降低（P＜0.05），鹿茸中药复方组CpG2 甲基化水平有降低趋势，差异不显著（P＞0.05）；仙灵骨葆阳性对照组CpG1、CpG2甲基化水平明显降低（P＜0.01），仙灵骨葆阳性对照组CpG3 甲基化水平有降低趋势，差异不显著（P＞0.05）。

表2 各组大鼠骨组织Runx2基因启动子-955 bp～-456 bp甲基化水平（± s）

表2 各组大鼠骨组织Runx2基因启动子-955 bp～-456 bp甲基化水平（± s）

注：与正常组比较：*P ＜0.05；与模型组比较：△P ＜0.05

CpG4.5 0.3800±0.0228 0.3900±0.0604 0.3567±0.0497 0.3633±0.0281组别正常组模型组鹿茸中药复方组仙灵骨葆阳性对照组n 6 5 6 6 CpG1 0.3500±0.1058 0.4960±0.1187*0.3617±0.0496△0.3883±0.0440△CpG2 0.5233±0.1249 0.7240±0.0833*0.5783±0.0646 0.4917±0.2472△CpG3 0.5517±0.0708 0.6000±0.0300 0.5400±0.0400△0.5433±0.0333

表3 各组大鼠骨组织Osterix基因启动子-1082 bp～-583 bp甲基化水平（± s）

注：与正常组比较：**P ＜0.01；与模型组比较：△P ＜0.05，△△P ＜0.01

CpG3 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 0.9783±0.0531组别正常组模型组鹿茸中药复方组仙灵骨葆阳性对照组n 6 5 6 6 CpG1 0.8483±0.0621 0.9820±0.0217**0.9333±0.0137△0.9000±0.0141△△CpG2 0.7500±0.0210 0.8360±0.0398**0.7850±0.0609 0.7033±0.0388△△

3 讨论

本课题组主要研究去卵巢骨质疏松症大鼠成骨细胞分化、成熟的重要特异性转录因子Runx2、Osterix[2]基因启动子的甲基化修饰，旨在从表观遗传学揭示成骨关键基因Runx2、Osterix 的甲基化修饰与PMOP 发病的关联以及中医学“肾主骨”理论指导下的鹿茸中药复方的疗效机理。

表观遗传修饰研究的是基因序列不改变，通过DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 和microRNA、染色质重塑等，产生可遗传的基因表达改变，是重要的基因表达调控机制之一。DNA 甲基化是重要的表观遗传修饰之一，由DNA 甲基转移酶催化，将甲基基团转移到基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上，胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶，是可逆的DNA 自然化学修饰方式，可随DNA 复制而遗传，在基因沉默、细胞分化、肿瘤和衰老等过程中发挥重要作用[3]。目前人们认为DNA 甲基化调控基因转录的可能机制有两个：①启动子序列甲基化DNA 与甲基化胞嘧啶结合蛋白结合，诱导染色质组蛋白脱乙酰基，构象改变，抑制基因转录[4]。②甲基化基团可阻止转录因子与基因调控序列结合，抑制基因转录[3]。近年研究表明DNA 能主动去甲基化[5]，启动、活化基因转录[3]。

Runx2、Osterix 是成骨细胞分化、成熟的重要特异性转录因子[2]，调控骨钙素、骨桥素、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原等多种重要成骨细胞表型基因的表达[6-7]，促进骨形成，对防治骨质疏松有重大意义。有研究显示，补肾中药通过上调骨髓基质干细胞表达Runx2、Osterix，提高大鼠骨量[8-9]。张添昊等[10]研究发现，左归丸、右归丸可提高去卵巢大鼠股骨骨髓Runx2 mRNA 及蛋白表达。本课题组前期研究显示，去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Runx2 mRNA 及蛋白表达明显降低，补肾益髓中药复方可上调之，有效防治绝经后骨质疏松症[11]；糖皮质激素性骨质疏松症大鼠骨组织Osterix mRNA 及蛋白表达明显降低，补肾中药可上调之，有效防治糖皮质激素性骨质疏松症[12]。

Roforth等[13]评估青年及老年女性间充质干细胞全细胞DNA甲基化水平，结果表明某些基因的甲基化水平可能与年龄相关的骨形成减弱导致的骨质疏松症相关。DNA 甲基化对成骨关键基因Runx2、Osterix 表达的影响目前存在争议。朱筱等[3]研究表明，降低Runx2 启动子甲基化水平，活化其转录，上调其表达。Liu H 等[14]研究表明，在成骨细胞祖细胞中，上调Runx2 和Osterix 甲基化，导致骨形成减少。Sepulveda H 等[15]研究表明，抑制DNA 甲基化会引起组蛋白修饰和染色质重塑改变，导致Sp7（Osterix）基因的表达。Zhang D 等[16]研究表明，DNA 甲基转移酶抑制剂上调Runx2、Osterix 表达。Zhang R P 等[17]研究表明，在间充质干细胞成骨分化模型中，Runx2、Osterix 等成骨特异基因启动子CpG 位点去甲基化伴随着成骨分化过程中其基因表达的增加。杨锋等[18]研究表明，左归丸含药血清通过降低Runx2、Osterix 基因甲基化促进骨髓间充质干细胞成骨分化。但是，Farshdousti Hagh M等[2]研究表明，在间充质干细胞成骨分化过程中，Runx2 启动子甲基化状态没有改变，而Osterix 启动子甲基化模式呈动态变化，Osterix 的表观遗传调控可能起主导作用。Li Z 等[19]研究表明，骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，Runx2 表达上调，但与其启动子区CpG岛甲基化无关。

那么，骨质疏松是否与成骨关键基因Runx2、Osterix 甲基化修饰的表观遗传失调有关？本研究采取切除雌性大鼠双侧卵巢的经典方法复制PMOP动物模型[20]，基于骨组织Runx2、Osterix 启动子甲基化水平，探究PMOP 发病的表观遗传学机制以及郑洪新教授在中医学“肾藏精生髓主骨”理论指导下并经多年科研、临床实践证明可有效防治PMOP 的鹿茸中药复方（君药鹿茸：补肾助阳、生精益血、强筋健骨，以君药拟定方名；臣药淫羊藿：温肾壮阳、强筋骨；佐药牡蛎：补肾、强骨节、潜阳补阴，全方共奏益肾填精、生髓壮骨之功）的疗效机理，阳性对照药选择国药集团同济堂（贵州）制药有限公司的仙灵骨葆胶囊（成份：淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄；功效：滋补肝肾、接骨续筋、强身健骨）。结果显示：模型组第1～6 腰椎骨密度比正常组明显降低，这说明PMOP 模型复制成功；鹿茸中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组第1～6腰椎骨密度均比模型组明显升高，这说明本研究鹿茸中药复方和仙灵骨葆可有效防治PMOP。模型组骨组织Runx2 启动子-955 bp～-456 bp CpG1、CpG2 和Osterix启动子-1082 bp～-583 bp CpG1、CpG2 甲基化水平比正常组明显升高，提示去卵巢造成骨组织Runx2、Osterix 启动子高甲基化，抑制其转录，下调其表达，进而下调其靶基因骨钙素、骨桥素、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原等成骨细胞表型基因的表达，抑制成骨细胞分化和成骨，导致骨质疏松。鹿茸中药复方和仙灵骨葆均可降低去卵巢骨质疏松大鼠骨组织Runx2、Osterix 启动子甲基化水平，促进其转录，上调其表达，进而上调其靶基因骨钙素、骨桥素、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原等基因的表达，促进成骨细胞分化和成骨，有效防治PMOP。

本课题组的研究结果显示，绝经后骨质疏松症的表观遗传学发病机制之一可能是骨组织Runx2、Osterix 启动子甲基化水平升高；鹿茸中药复方可能通过降低骨组织Runx2、Osterix 启动子甲基化水平，有效防治该病。本研究为阐明PMOP的发病机制提供了一个新的途径，并为临床探索PMOP 的防治及疗效机理提供了新的靶点。