安 雨，刘雅洁，邢国刚，金滋润2，，西 珂2，，霍涌玮，赵百孝

（1. 北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2. 北京大学神经科学研究所 北京 100191；3. 北京大学基础医学院神经生物系 北京 100191；4. 西安交通大学医学部基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系 西安 710061；5. 北京中医药大学中医学院 北京 100029）

弱精子症（Asthenozoospermia）是引起男性不育症的常见病因之一，以精子活力下降为主要表现[1]，弱精子症患者的精液参数指标表现为快速前向运动的精子比例与慢速前向运动的精子比例之和，即A+B 级精子数小于50%，或A级精子数小于25%[2]。随着现代社会的发展，多种多样的污染增加，生活、工作压力大，以及随之而来的生育年龄的推迟，不育症的发病率越来越高[3-4]。流行病学显示，全球有10%-15%的适龄夫妻被不育症困扰，其中男性因素占到了50%[5]。目前，中西医针对弱精子症的研究取得了一定成效，但还是有部分患者的疗效不能令人满意[6]，治疗弱精子症还需要更加多样、有效的方法。本课题组前期研究发现，临床诊室浓度的艾烟，对正常Wistar大鼠的生殖机能不仅无害而且还有促进作用[7]，具体表现为可以提高大鼠的精子浓度、精子活力、精子活率，提高大鼠血清总睾酮、游离睾酮、睾酮分泌指数。本研究拟使用生殖毒性药物奥硝唑灌胃建立弱精子症大鼠模型，观察艾烟对弱精子症模型大鼠生殖方面的影响，以达到为治疗男性弱精子症提供新思路的目的。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

奥硝唑（北京华威锐科化工有限公司），羧甲基纤维素钠（百奥百乐生物科技有限公司），普通清艾条（长20 cm，直径2 cm，湖北李时珍中药饮片有限公司），市售香烟（双喜牌，焦油含量11 mg/支），玻璃缸（自制，80 cm× 80 cm × 60 cm，玻璃壁上设有硬币大小的圆孔），光散射式数字粉尘测试仪（北京宾达绿创科技有限公司），精子计数板（南宁松景天伦生物科技有限公司），水浴锅（北京市长风仪器有限公司），计算机辅助精子分析系统（北京伟力新世纪科技发展有限公司，型号：WLJY-9000），普通光学显微镜，台式冷冻离心机（型号：5417R，eppendorf）。睾酮（T）及促黄体生成素（LH）Elisa试剂盒（北京百诺威生物科技有限公司）。

1.2 动物分组、实验

32 只成年雄性SD 大鼠，体质量200-230 g ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0006。将大鼠按体重随机分为4组：溶剂对照组（vehicle 组）8 只、模型组（ORN 组）8 只、艾烟治疗组（ORN+MS组）8只、香烟对照组（ORN+CS组）8只。适应饲养7天，期间大鼠均自由食水，每天换水，两天换一次垫料，保持鼠笼清洁干燥。饲养环境温度维持在22℃±2℃，相对湿度50%-60%，保持光照12h（8:00-20:00）和黑暗12h（20:00-次日8:00）交替。

制备奥硝唑溶液：先配制0.2%羧甲基纤维素钠溶液：0.2 g羧甲基纤维素钠，加100 mL灭菌双蒸水，同时加两滴100 μL Tween-20，搅拌均匀后即可；再将0.25 g奥硝唑加1 mL的0.2%羧甲基纤维素钠溶液，置于干净研钵中研碎至糊状，奥硝唑溶液配制完成。

模型组、艾烟组、香烟组：每组均使用奥硝唑溶液灌胃，每次400 mg/kg，每日1次，连续灌胃10天。从第11 天起，将三个组的奥硝唑剂量调至200 mg/kg，每日1 次，并开始艾烟和香烟干预，每天20 min，每日1 次，每周6天。实验共8周。

溶剂对照组：只给与等体积的0.2%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，每日1次，共灌胃8周，不进行其他干预。

艾烟浓度的控制：先用粉尘测试仪测量京津地区夏季临床艾灸场所PM10 浓度，再将艾条通过圆孔插入玻璃缸内，再用该粉尘仪检测玻璃缸中艾烟，当浓度达到3倍临床艾烟浓度时，将一整组大鼠连同鼠笼一起放入玻璃缸干预。香烟浓度与艾烟浓度保持一致。

1.3 标本采集与检测

各组大鼠在治疗结束后24h，用水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，放血处死实验动物，并迅速摘取睾丸、附睾，备用。

血液标本采用ELISA 法，严格按照试剂盒说明书进行操作。

采用扩散法收集附睾尾中的精子进行精子参数分析[8]。将2 mL 的0.9%氯化钠溶液倒入标记好的一次性培养皿中，37℃水浴预热，将双侧附睾尾放入其中，用剪刀在附睾尾轻轻地剪3刀，在37℃水浴锅中放置2 min，轻轻混匀，取20 μL 液体加到37℃预热的精子计数板上，随机选6 个视野，2 min 内完成测试。使用计算机辅助精子分析系统检测精液主要指标精子密度、精子活力、精子活率、A 级精子数、A + B 级精子数。

1.4 睾丸组织形态

取大鼠睾丸组织，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片厚5 μm，贴于载玻片上，室温干燥。常规HE染色后，光镜下观察照相。

1.5 统计学分析

实验结果用SPSS 20.2 统计软件分析。所有数据进行正态性检验和方差齐性检验，对符合正态性分布且方差齐的计量数据采用（xˉ±s）表示，用单因素方差分析ANOVA 法进行分析，若组间数据有显著性差异，再用LSD 法进行组间多重比较。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 艾烟可明显提高弱精子症模型大鼠的精子质量

与溶剂对照组相比，模型组大鼠的精子质量明显下降，包括精子活力、精子活率、A 级精子数、A+B 级精子数均显著下降（P ＜0.01），这表明弱精子症大鼠模型建立成功。

表1 艾烟对弱精子症模型大鼠精子参数的影响

图1 睾丸组织200镜下

给予艾烟干预后，弱精子症模型大鼠精子的各项指标均有显著改善（见表1），具体表现为：与模型组相比，艾烟组大鼠的精子活力、精子活率、A 级精子数和A+B 级精子数明显提高（P ＜0.01）；与溶剂组相比，艾烟组的精子活力、精子活率、A级精子数、A+B级精子数无差异（P ＞0.05）。

香烟对照组大鼠的精子质量产生了意料之外的变化，表现为：与溶剂组和艾烟组相比，香烟组的精子活力、精子活率、A级精子数、A+B级精子数显著低下（P ＜0.01），但与模型组相比，香烟组的精子活力、精子活率、A+B级精子数有所回升（P ＜0.05）。

四个组之间的精子密度无统计学差异（P ＞0.05）。

2.2 艾烟可调节大鼠血清睾酮、促黄体生成素水平（nmol/L）

与溶剂对照组相比，模型组和香烟组大鼠的血清睾酮的含量显著下降（P ＜0.01）、促黄体生成素的含量上升（P ＜0.01）；给予艾烟干预后，艾烟组与模型组相比，睾酮的含量上升（P ＜0.01）、促黄体生成素的含量下降（P ＜0.05），而香烟组没有改善，效果明显低于艾烟组（P ＜0.01）（见表2）。

2.3 大鼠睾丸组织的形态学变化

由图1可以看出，溶剂对照组大鼠睾丸组织中，生精小管排列紧密、间隙紧凑，生精小管的生精上皮细胞完整，基底膜厚度均匀，各级生精细胞排列整齐且层次清晰，管腔内精子丰富。模型组大鼠睾丸组织中，各个生精小管间的间隙增大，生精小管管腔扩大，基底膜变薄，生精细胞的层次混乱，无法清楚分级，管腔内的精子数量明显减少。给予艾烟干预后，生精小管的排列相对紧密，管腔也有所缩小，生精上皮和基底膜的厚度增加，各级生精细胞的排列层次也有恢复，管腔内精子数量明显增加，与溶剂对照组相比还存在一定的差距。香烟组的病变程度比模型组更重一些，表现为生精小管的排列更为稀疏，生精小管的管腔也更大，基底膜更薄，各级生精细胞的数量显著减少。

表2 艾烟对弱精子症模型大鼠血清睾酮、促黄体生成素含量的影响

3 讨论

弱精子症属于中医学的“精冷”范围，病机多为肾虚。其发病原因和机制较为复杂[9-10]，染色体异常、微生物感染、内分泌紊乱、精索静脉曲张及自身免疫等因素是弱精子症较明确的病因，氧化应激和细胞凋亡是其较明确的发病机制。

成功建立弱精子症动物模型，是探索弱精子症新疗法和机制的前提。在临床上，奥硝唑被广泛用于防治术后感染和生殖系统感染[11]。国内外研究发现，奥硝唑可以影响附睾中精子的成熟和运动，从而导致雄性动物不育且这种影响是可逆的[12]，这一点正是造模的基础，并且需要在造模成功后，不间断给药以维持模型的弱精子效果。有研究[13]每天用400 mg/kg 的剂量灌胃造模；也有研究[14]每天用200 mg/kg 的剂量造模。考虑到本实验中造模及干预时间长，所以前10天用400 mg/kg，从第11 天开始，将奥硝唑的剂量减半。本实验中的模型组与溶剂组相比，精子参数明显下降，睾丸生精小管管腔扩大，小管之间间隙增大，生精细胞层次排列紊乱，管腔内精子数量明显减少，其造模效果与之前的研究相似，说明弱精子症模型制备成功。

艾灸是中医常用的疗法之一，国内外的临床研究表明灸法治疗弱精子症疗效确切，包括麦粒灸[15]、艾条灸[16]、脐灸[17]；机制研究[18]也发现，艾灸可以改善弱精子症大鼠精子质量，可能与灸法的温热刺激能调节性激素T、LH、FSH 水平和细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、CytC 水平有关。艾灸通过清除自由基抗氧化[19-21]和抑制细胞凋亡[22-25]这两大途径，能治疗包括弱精子症在内的多种疾病。

艾灸的起效途径[26]主要包括温热效应、光辐射、艾烟等。对艾叶成分的研究[27]发现，艾叶中富含挥发油（如桉油精、松油醇、1,8-桉叶油素）、黄酮（如黄酮醇及其苷）等物质，燃烧后产生的艾烟可以抗氧化[20]，抗神经元凋亡[28]，抗炎性反应[29]，调节脂质代谢[30]。由此可以提出假说，艾烟能通过从抗氧化应激和抗细胞凋亡的途径治疗弱精子症，下一步的研究应着眼于这两方面指标的变化。此外，艾烟作用于人体主要是经过嗅觉系统，这与中医的芳香疗法密切相关，气味可能刺激嗅觉神经和大脑边缘系统，今后也可以考虑切断嗅觉通路[31]，来观察艾烟对弱精子症的疗效。

精子密度、精子活力、精子活率、A 级精子数、A+B级精子数等必备指标常用于评价以下四个方面：男性生育能力和精子的质量、睾丸组织的损害程度、精子的发生功能、观测雄鼠的生殖功能[18]。本实验中，与溶剂对照组相比，模型组大鼠的精子活力、精子活率、A级精子数、A+B 级精子数均显著降低（P ＜0.01）；经过艾烟干预后，艾烟组大鼠的这些指标均升高（P ＜0.01），这说明艾烟能明显改善奥硝唑诱导的弱精子症模型大鼠的精液质量。这与本课题组的前期研究[7]相一致。

精子的产生，在内分泌等许多因素下进行，过程较为复杂，如果睾丸受损，往往表现为睾酮（T）的降低和促黄体生成素（LH）的升高[18]，T/LH 的比值也是衡量患者睾丸生精水平的重要参考指标[32]。因此，血清性激素T 和LH 的水平可以反映精子的发生的情况。本实验中，与溶剂组相比，模型组大鼠的T 降低而LH 升高（P ＜0.01），经过艾烟干预后，艾烟组大鼠的T 升高（P ＜0.01）、LH 降低（P ＜0.05），激素水平得到显著改善。

香烟烟雾以尼古丁为主，是一种氧化剂，可直接造成生殖系统的氧化应激损伤[33]，严重影响精液质量，也会抑制睾酮的合成[34]，本实验的血清激素和病理结果证实了其副作用。虽然香烟提高了精子活力、活率、A+B 级精子数，但没有提高A 级精子数，更远远没有达到像艾烟组一样的效果，前人也有类似的发现[35]：吸烟6 周后小鼠的精子活力没有下降反而有上升趋势。由于香烟对生殖系统的损伤存在时长和剂量的依赖性[36]，所以本课题组猜测，香烟的刺激提高了机体的兴奋性，类似于尼古丁促进中枢神经系统对信息的处理[37-38]。

本实验的量-效关系、时-效关系还可进一步完善，如提高艾烟的浓度、设置不同浓度的分组，延长或缩短单次艾烟干预的时长，以寻找最佳浓度和最佳干预时长。

综上所述，本课题组得出结论：艾烟可以提高弱精子症模型大鼠的精子质量，提高精子活力、精子活率、A级精子数、A+B级精子数；提高弱精子症模型大鼠血清睾酮水平、降低促黄体生成素水平；减轻弱精子症模型大鼠睾丸的病变；从而保护弱精子症模型大鼠的生殖功能，对临床弱精子症患者的治疗具有一定的参考价值。