王顺民 杨晓丹 曾勇

[摘要] 目的 探討利血平与大鼠主动脉血管平滑肌细胞（RA-VSMC）自噬的关系。 方法 用含利血平或者厄尔平衡盐缓冲液（EBSS）培养基体外培养RA-VSMC，MTT法检测对照组、5 μmol/L利血平组、10 μmol/L利血平组、20 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组RA-VSMC的细胞活力;mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪RA-VSMC的自噬小体;实时荧光定量PCR（qPCR）以及蛋白免疫印迹（WB）实验检测对照组、10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组RA-VSMC自噬相关基因LC3和Beclin1的表达。 结果 MTT结果显示，与对照组比较，5 μmol/L利血平组、10 μmol/L利血平组、20 μmol/L利血平组和50 μmol/L利血平组细胞活力均显著降低（P < 0.05或P < 0.01）;mRFP-GFP-LC3双荧光体系结果显示，对照组和10 μmol/L利血平组细胞中无明显自噬小体，50 μmol/L利血平组和EBSS组细胞形成明显自噬小体;qPCR结果显示，与对照组比较，10 μmol/L利血平组LC3 mRNA表达水平差异无统计学意义（P > 0.05），50 μmol/L利血平组和EBSS组LC3 mRNA表达水平显著升高（P < 0.05或P < 0.01）;10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组Beclin1 mRNA表达水平显著升高（P < 0.01）;WB结果显示，与对照组比较，10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率显著升高（P < 0.01），10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组Beclin1蛋白表达水平显著升高（P < 0.01）。 结论 利血平可能通过自噬机制调控VSMC的增殖。

[关键词] 利血平;血管平滑肌细胞;增殖;自噬

[中图分类号] R692.31          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（a）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the relationship of Reserpine and the autophagy of rat aortic vascular smooth muscle cells （RA-VSMC）. Methods RA-VSMC was cultured in medium with Reserpine or Earles balanced salt solution （EBSS） in vitro. MTT assay was used to detect the effect of Reserpine on the proliferation of RA-VSMC with 5 μmol/L Reserpine， 10 μmol/L Reserpine， 20 μmol/L Reserpine and 50 μmol/L Reserpine. The dual-fluorescence mRFP-GFP-LC3 was used to trace the autophagosomes of RA-VSMC. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） and Western blot （WB） were used to detect the expression of LC3 and Beclin1. Results The MTT results showed that compared with the control group， the cell viability in the 5 μmol/L Reserpine group， 10 μmol/L Reserpine group， 20 μmol/L Reserpine group and 50 μmol/L Reserpine group were significantly reduced （P < 0.05 or P < 0.01）. The results of the dual-fluorescence mRFP-GFP-LC3 showed that there were no significant autophagosomes in the cells of the control group and the 10 μmol/L Reserpine group， and the 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group formed significant autophagosomes. qPCR results showed that compared with the control group， there was no significant difference in LC3 mRNA expression level in the 10 μmol/L Reserpine group and the control group （P > 0.05）. LC3 mRNA expression levels in 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Beclin1 mRNA expression levels was significantly increased in 10 μmol/L Reserpine group， 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group （P < 0.01）. WB results showed that， compared with the control group， the 10 μmol/L Reserpine group， 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio increased significantly （P < 0.01）， Beclin1 protein expression was significantly increased in 10 μmol/L Reserpine group， 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group （P < 0.01）. Conclusion Reserpine may regulate the proliferation of vascular smooth muscle cells through autophagy.

[Key words] Reserpine; Vascular smooth muscle cells; Proliferation; Autophagy

血管平滑肌细胞（VSMC）是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，通过缓慢的轻度收缩以维持血管壁的张力[1]。VSMC的异常增殖、凋亡、纤维沉积等病理改变，引起血管壁增厚、管腔变窄和血管壁结构改变，最终导致血压增加[2-3]。自噬被称为Ⅱ型程序性细胞死亡，是一种进化保守的分解代谢途径[4]。利血平是一类从萝芙木属多种植物中提出的吲哚型生物碱[5]，常用于治疗高血压[6]和精神分裂症[7]。本研究利用利血平干预大鼠主动脉血管平滑肌细胞（RA-VSMC），观察RA-VSMC自噬现象，为临床上利血平治疗高血压提供新的实验支持。

1 材料与方法

1.1材料

原代大鼠主动脉平滑肌细胞（RA-VSMC），利血平（MCE，货号：27769）。

1.2 仪器

电子天平（RADWAG，AS 310.R2，310 g×0.1 mg）;倒置荧光显微镜（OLYMPUS，CKX53）;多功能酶标仪（PE，VICTOR NIVO）;化学发光成像系统（上海天能，5200 Multi）;定量PCR仪（Analytik jena，qTower 3.2G）

1.3 试剂

DMEM高糖培养基（Gibco，货号：8118099）;胎牛血清（Gibco，货号：42F3575K）;厄尔平衡盐缓冲液（EBSS）（Procell，货号：PM17JAN009）;MTT（Sigma）;Anti-LC3（proteintech，货号：00062683）;Anti-Beclin 1（proteintech，货号：00057705）;Anti-β-actin（proteintech，货号：10004413）;Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP（联科，货号：A90534）;BeyoFast SYBR Green qPCR Mix（2×）（Beyotime，货号：071219191022）。

1.4 細胞培养

RA-VSMC细胞培养于含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，将细胞培养在37℃，5%CO2的无菌培养箱中。

1.5 MTT法检测细胞增殖

RA-VSMC以1×105个/mL的比例接种于96孔细胞培养板中，培养至90%以上的细胞贴壁。设置5个分组：对照组、5 μmol/L利血平组、10 μmol/L利血平组、20 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组。各组细胞更换为对应培养基培养48 h，更换新鲜培养基，加入10 μL MTT（0.5 mg/mL），继续培养4 h。移除培养基，添加DMSO，摇床轻摇15 min，酶标仪下测定波长492 nm处OD值。

1.6 双荧光体系观察自噬小体

RA-VSMC细胞以1×105个/mL的比例接种于6孔板中，待细胞密度达到80%后，将mRFP-eGFP-LC3质粒[8]转染细胞，6 h后更换为完全培养基培养24 h。设置4个分组：对照组、10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组。各组细胞更换为对应培养基或EBSS溶液，继续培养6 h。去除培养基，4%多聚甲醛溶液固定细胞10 min，DAPI染核。荧光显微镜下观察细胞内绿色和红色LC3的亮点（自噬体）的数量。

1.7 实时荧光定量PCR（qPCR）检测LC3和Beclin1 mRNA的表达

RA-VSMC细胞以1×105个/mL的比例接种于6孔板中，培养48 h。细胞分组同“1.6”。各组细胞更换对应培养基或EBSS溶液，继续培养6 h，收集细胞。采用Trizol法提取细胞总RNA，并反转录为cDNA。采用qPCR法检测LC3和Beclin1 mRNA的表达，反应体系为20 μL。使用Primer Premier 5.0进行引物设计，引物序列由上海生工生物公司合成。引物序列见表1。

1.8 蛋白免疫印迹实验检测LC3和Beclin-1蛋白的表达

细胞培养及分组同“1.6”。采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白。蛋白经SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜（LC3 1∶1000;Beclin1 1∶1500;β-actin 1∶3000）。相应标记HRP的辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，使用化学发光液进行显色。使用Image J软件测定吸光度，计算蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验或采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度利血平对RA-VSMC活力的影响

MTT结果显示，与对照组比较，5 μmol/L利血平组、10 μmol/L利血平组、20 μmol/L利血平组和50 μmol/L利血平组细胞活力均显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见图1。

2.2 不同浓度利血平对RA-VSMC自噬的影响

双荧光体系观察RA-VSMC中绿色和红色LC3-Ⅱ颗粒（自噬体），结果显示，对照组和10 μmol/L利血平组细胞中无明显自噬小体，50 μmol/L利血平组和EBSS组细胞形成明显自噬小体，最右侧一列为左侧选中区域放大后结果。见图2（封三）。

2.3 不同浓度利血平对自噬相关基因表达的影响

与对照组比较，10 μmol/L利血平组LC3 mRNA表达水平差异无统计学意义（P > 0.05），50 μmol/L利血平组LC3 mRNA表达水平显著升高（P < 0.05），EBSS组LC3 mRNA表达水平显著升高（P < 0.01）;10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组Beclin1 mRNA表达显著升高（P < 0.01）。见图3。

2.4不同浓度利血平对自噬相关蛋白表达的影响

与对照组比较，10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率显著升高（P < 0.01）;10 μmol/L利血平组、50 μmol/L利血平组和EBSS组Beclin1蛋白表达显著升高（P < 0.01）。见图4～5。

3 讨论

高血压作为一种最常见的慢性病，是心脑血管疾病最主要的危险因素，例如心肌梗死、脑梗死、慢性肾脏疾病等[9]。利血平是一类广泛用于轻度和中度高血压治疗的药物，同时还可用于治疗精神分裂。一般认为，利血平通过抑制交感神经末梢囊泡中神经递质的合成和贮存，妨碍交感神经冲动，导致血管扩张，血压下降。最新研究显示[10]，利血平可通过诱导自噬小体导致神经细胞死亡，提示参与神经细胞自噬可能是利血平治疗神经退行性疾病的一种方式。作为血管的主要组成部分，VSMC的异常增殖会引起血管结构的改变，导致血压升高[11]。因此本研究探讨了利血平是否参与体外培养大鼠主动脉VSMC的自噬。

自噬现象是一种十分保守的细胞行为，在维护细胞内稳态方面起重要作用[12-13]，自噬调控的失调与多种疾病相关[14-16]。当细胞发生自噬后，LC3前体被ATG4剪切变成LC3-Ⅰ，随后LC3-Ⅰ在ATG7和ATG3的作用下，经过一系列反应，生成LC3-Ⅱ，LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ显示了自噬水平的高低[17]。Beclin1是细胞自噬的关键起始蛋白，主要与PI3K形成复合物，调节ATG蛋白在自噬前体中的定位[18-19]。本研究通过mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪自噬小体，通过免蛋白疫印迹实验检测了LC3-II/LC3-Ⅰ和Beclin1的表达，确认利血平可诱导主动脉平滑肌细胞产生自噬。已有研究显示[20-21]自噬与VSMC的凋亡、增殖、迁移、基质分泌、收缩/舒张和分化等存在重要联系;自噬直接影响着VSMC的生存与功能，并与血管疾病的发生发展也有密切联系。自噬功能的缺陷或不足将导致动脉粥样硬化和血管变窄。本研究结果显示，诱导VMSC自噬可能是利血平发挥降低血压功能的另一种方式。

综上所述，本研究提示利血平对RA-VSMC具有一定的抑制作用，并诱导细胞产生自噬作用，均呈现浓度依赖性。因此，笔者推测利血平可直接作用于VSMC，并可能通过抑制VSMC的增殖达到降压的效果。本研究揭示利血平在高血压治疗上的新靶点，为新药开发及高血压治疗提供新的思路和理论依据。

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（收稿日期：2019-10-17  本文編辑：刘永巧）