马胜举，赵德华，马 坤，倪 敏，王丽雯，欧阳运佳，张 垒,张小安

郑州大学第三附属医院河南省新生儿疾病筛查中心，河南郑州 450052

遗传代谢病(IMD)又称为先天性代谢缺陷(IEM)，是由于基因缺陷，导致维持人体正常代谢需要的部分酶、载体等生物物质无法合成而引起的代谢途径阻断，是以功能障碍为主要表现的一类疾病。IMD种类较多，目前已经被发现的有500多种，单一病种患病率低，但此类疾病的群体患病率较高，且新的疾病病种仍在不断被发现，国外研究表明，该病总患病率为0.039%～0.128%[1-3]，主要包括氨基酸代谢障碍(包括尿素循环障碍、支链氨基酸代谢异常、含硫氨基酸代谢异常等)、有机酸血(尿)症、脂肪酸氧化缺陷、糖代谢障碍等。质谱主要是将被测物质分子电离成各种质荷比(m/z)不同的带电粒子，然后应用电磁学原理，使这些带电粒子按照质荷比大小在空间或时间上产生分离排列成图谱，通过测定粒子峰的强度，以此获得确定化合物的分子量、分子式，而串联质谱是由2个质谱仪经1个碰撞室串联而成，来实现物质的定性和定量测定。河南省新生儿疾病筛查中心于2012年12月开始采用串联质谱技术对新生儿进行IMD的筛查，现将2013年1月至2019年8月采用非衍生化串联质谱技术筛查的新生儿IMD结果进行 简要分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2013年1月至2019年8月在河南省新生儿疾病筛查中心(以下简称“本中心”)进行IMD筛查的850 486例新生儿为研究对象，其中男460 793例、女389 693例。纳入标准为出生后3～7 d按照《新生儿疾病筛查技术规范(2010版)》进行采血的新生儿，且监护人均已签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集 按照《新生儿疾病筛查技术规范(2010版)》要求，新生儿出生72 h且充分哺乳8次以上，采集足跟血于新生儿筛查采集卡滤纸片上，室温下自然晾干，保存于2～8 ℃冰箱内。

1.2.2仪器与试剂 本中心采用的是美国API3200MD串联质谱仪、日本岛津SIL-20AC高效液相色谱仪自动进样器，美国Waters AcquityTMTQD串联质谱仪、Waters2777C自动进样器、Waters1525高效液相色谱仪共两套液相串联质谱仪；试剂采用的是芬兰PerkinElmer公司的非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒。

1.2.3检测方法 用半自动打孔仪(规格1296-071)打3.2 mm血片于V型截底微孔板的板孔内，每孔加入100 μL含内标的工作液，用黏性塑料贴膜封板，并置于45 ℃、700 r/min转速下孵育45 min，然后转移75 μL溶液至V型底微孔板内，最后用铝箔封套封板并上机检测。

1.2.4实验室质量控制 每块V型板标本前后均有试剂盒自带高、低水平质控品，与标本在同一条件下进行检测；每年参加国家卫生健康委员会临床检验中心组织的室间质评，成绩均合格。

1.2.5可疑阳性的复查、召回及确诊 首次可疑阳性结果要原血片复查，两次结果一致为初筛可疑阳性，并对其重新采血进行召回，召回标本仍阳性者进行血常规、生化检查、尿气相色谱(GC/MS)、基因检测等相关检查来确诊IMD。一旦确诊为IMD患儿，由本中心IMD专家负责建立患儿档案统一管理，并进行随访与治疗。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0进行分析，计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1筛查结果 本中心筛查的850 486例新生儿中，初筛可疑阳性者15 956例，初筛可疑阳性率1.88%(15 956/850 486)；召回14 658例，召回率91.87%(14 658/15 956)；召回复查可疑阳性1 546例，可疑阳性率0.18%(1 546/850 486)，其中1 228例进行基因检测，275例定期观察血非衍生化串联质谱结果，43例拒绝做基因检测，并且本中心将初筛阴性新生儿纳入儿童保健系统，定期随访，至今未发现假阴性情况。

2.2确诊阳性结果 最终通过基因检测确诊15种IMD，共计408例，其中男233例、女175例，男女比例为1.33∶1。IMD阳性预测值为2.78%(408/14 658)，总患病率为1∶2 085(408/850 486)，其中男性患病率1∶3 650(233/850 486)，女性患病率1∶4 860(175/850 486)，男女患病率差异无统计学意义(χ2=3.80，P>0.05)。IMD患病情况见表1。

表1 IMD患病情况

2.3确诊患病率较高的疾病检测结果 确诊患病率较高的疾病有甲基丙二酸血症、高苯丙氨酸血症、原发性肉碱缺乏症。甲基丙二酸血症：尿GC/MS中甲基丙二酸水平为142.0(15.54～955.4)nmol/(mg·肌酐)，参考值为0.2～3.6 nmol/(mg·肌酐)；甲基枸橼酸水平为2.56(0.22～32.65)nmol/(mg·肌酐)，参考值0～1 nmol/(mg·肌酐)。基因突变：MMACHC 161例(88.5%)，最常见突变为c.609G>A(23.63%)，其次为c.482G>A(9.24%)；MUT 21例(11.5%)，最常见突变c.1663G>A(3.08%)。高苯丙氨酸血症突变率较高的为c.728G>A(17.73%)、c.158G>A(8.51%)、c.1197A>T(8.16%)、c.611A>G(7.45%)、c.721C>T(5.32%)、c.1068C>A(4.26%)、c.1238G>C(3.90%)。

原发性肉碱缺乏症常见的基因突变：SLC22A5基因常见突变为c.1400C>G(42.72%)、c.760C>T(11.93%)及c.51C>G(7.57%)。

3 讨 论

本中心对IMD初筛可疑阳性新生儿按疾病种类通常进行血常规、生化、尿GC/MS等相关检查来进一步诊断IMD，若相关检查正常，会将这些新生儿纳入儿童保健系统，定期随访；若相关检查结果异常，进一步进行基因检测来确诊IMD。非衍生化串联质谱技术筛查新生儿IMD结果显示，本省新生儿IMD初筛可疑阳性率1.88%，召回率91.87%，召回复查可疑阳性率0.18%，总阳性预测值为2.78%，与国内文献报道初筛可疑阳性率1.20%～2.21%，召回率72.86%～94.50%[4-5]，以及总阳性预测值为2.60%～3.38%[5-6]相似。本中心对1 228例可疑阳性患儿进行基因检测，最终确诊408例，由此可以看出非衍生化串联质谱技术初筛可疑阳性数与基因检测最终确诊数仍相差较大，假阳性率较高，但本研究所得阳性预测值与国内文献报道的差异较小，原因可能为非衍生化串联质谱技术的高灵敏度也会导致较高的假阳性率，并且与该技术是筛查试验而非确诊试验有关，也可能与新生儿各器官发育还未成熟，机体正常代谢机制尚未完善等因素有关。因此，不断积累临床经验，优化参考值，提高阳性预测值，降低假阳性率是进一步工作的重点。由于采血人员操作、血片运送、血片质量以及某些疾病迟发型表现等因素可能导致假阴性结果，因此本中心将初筛阴性新生儿纳入儿童保健系统，定期随访，目前未发现假阴性情况。

IMD虽然单一病种患病率较低，但因种类较多，总体患病率较高，本省新生儿IMD总患病率为1∶2 085(408/850 486)，高于国内其他省市患病率，例如上海患病率1∶3 529[7]，浙江省患病率1∶5 626[8]。本研究结果显示，患病率较高的病种为甲基丙二酸血症，患病率为1∶4 673，高于国内[9]以及国外研究[10-11]报道的1∶35 000～1∶104 000，同时高于上海地区的1∶39 000和浙江地区的1∶65 000[12]，以及香港地区报道的1∶177 000[13]、台湾地区报道的1∶85 000[14]。甲基丙二酸血症常表现为严重的代谢性酸中毒，新生儿、婴幼儿期病死率很高，本研究发现，血同型半胱氨酸高的基因检测结果显示其基因型为MMACHC，最常见突变为c.609G>A(23.63%)，其次为c.482G>A(9.24%)，符合合并型甲基丙二酸血症的诊断；单纯型甲基丙二酸血症的基因均为 MUT 型，最常见突变为c.1663G>A(3.08%)，本省主要类型是cblC型，属于维生素B12有效型[15]，此类型患儿预后良好，因此，早期诊断和治疗有利于改善预后；其次为高苯丙氨酸血症，患病率为1∶5 452，高于国内平均患病率1∶11 144[16]。同时，本研究显示，高苯丙氨酸血症基因突变率较高的为c.728G>A(17.73%)、c.158G>A(8.51%)、c.1197A>T(8.16%)、c.611A>G(7.45%)，其次为c.721C>T(5.32%)、c.1068C>A(4.26%)、c.1238G>C(3.90%)，该病在新生儿期多无明显临床症状，一般至3～4个月时患儿毛发、皮肤和虹膜色泽变浅，智能发育落后明显，如不经治疗，常在幼儿期死亡。因此，开展新生儿IMD筛查，尽早发现高苯丙氨酸血症患儿，在出现临床症状之前开始治疗，防止发生智力低下及不可逆的损伤尤为重要。综上所述，本省是甲基丙二酸血症、高苯丙氨酸血症的高发区，而本省原发性肉碱缺乏症患病率为1∶31 499，高于其他国家的患病率(1∶40 000～1∶120 000[17])，但低于郑静等[18]报道的浙江省原发性肉碱缺乏症患病率1∶23 862，这可能与地域、筛查人群等情况不同有关。本研究显示，原发性肉碱缺乏症突变基因为SLC22A5，常见突变为c.1400C>G(42.72%)、c.760C>T(11.93%)及c.51C>G(7.57%)，该病会出现渐进性的肌无力及心力衰竭，心力衰竭会持续恶化，如不治疗会导致死亡，一旦确诊为原发性肉碱缺乏症的患儿要注意避免饥饿及长时间高强度运动，终身需要左旋肉碱替代治疗。

另外，本省IMD患病率相对较低的病种是3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症。3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症患病率为1∶85 049，低于洪芳等[19]报道的浙江省患病率(1∶68 900)；同时，本研究中短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患病率为1∶94 498，低于郑静等[18]报道的浙江省患病率(1∶68 936)，因此3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症与短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的患病率在不同地区有较大差异。

IMD属于单基因遗传病的一部分，绝大多数是常染色体隐性遗传，高危家庭再次生育此类疾病患儿的概率仍较高。因此，新生儿IMD的筛查不仅可以使IMD患儿早发现、早治疗，避免疾病产生的不可逆损伤，有效地降低患儿的伤残率，做好出生缺陷的三级预防，还能指导有IMD先证者的家庭计划再次生育时做好基因产前诊断，以最大限度地避免严重IMD患儿出生，对于出生缺陷的二级预防有重大意义。非衍生化串联质谱技术具有高灵敏度、高特异性、高选择性及快速检测的特点，可以在3 min内对一个标本进行几十种IMD的检测，一项试验检测多种IMD的优越性使其应用于大规模的新生儿IMD筛查成为现实，使本省IMD筛查、诊治和预防水平得到显著提高。