张 瑞，秦永亮，李 姣，郭玉楷，吴 欣，李永军

河北医科大学第二医院检验科，河北石家庄 050000

近年来的流行病学研究表明，一些植物来源化学成分的摄入水平与肿瘤、感染的发生、发展密切相关[1]。这些成分因为具有高效、低毒的特性而备受关注。白藜芦醇是虎杖的有效成分之一，是一种天然多酚化合物，具有广泛的药理活性，生物利用度较高。红葡萄皮中有高水平的白藜芦醇。本课题组的前期研究表明，白藜芦醇具有一定的抗白念珠菌活性，但其作用机制不详[2]。有研究表明，白藜芦醇可通过诱导真菌细胞凋亡发挥抗菌作用[3]。本研究探讨了白藜芦醇通过诱导凋亡发挥抗白念珠菌活性的机制。

1 材料与方法

1.1菌株 白念珠菌ATCC 90028，由北京协和医院惠赠。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 流式细胞仪为美国BD公司产品；恒温培养箱为上海博迅公司产品。

1.2.2试剂 白藜芦醇购自Sigma公司，两性霉素B(AmB)购自Solarbio公司。PBS缓冲液pH值为7.0；RPMI-1640培养基为Solarbio公司产品；蜗牛酶为Solarbio公司产品；Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒为凯基公司产品；活性氧检测试剂盒为Solarbio公司产品；线粒体膜电位(MMP)检测试剂盒为Solarbio公司产品。

1.3方法

1.3.1菌株的活化及菌液配制 从4 ℃保存的沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)上挑取白念珠菌ATCC 90028单菌落接种于沙氏液体培养基中，35 ℃摇床振荡(200 r/min)过夜培养，使菌株处于对数生长期，离心收集菌体，PBS洗涤两次后，用RPMI-1640稀释至2×106CFU/mL备用[4]。

1.3.2菌株的凋亡诱导 将2 mL指数生长期(A600=0.5)的白念珠菌悬液(密度为2×106CFU/mL)接种于24孔培养板中，同时将白藜芦醇分别加入孔板中，使终浓度分别为0.256、0.128、0.064 mg/mL，另设不加药的空白对照组和加AmB(终浓度为0.5 μg/mL)的阳性对照组。37 ℃静置孵育2 h，离心后无菌PBS洗3次，然后用Annexin Ⅴ-FITC和PI的标记液混匀(密度为106CFU/mL)。室温避光37 ℃孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.3白藜芦醇对白念珠菌活性氧(ROS)的影响 对指数生长期的白念珠菌悬液进行不同的加药处理后(同1.3.2)，37 ℃孵育12 h，离心收集白念珠菌细胞，PBS缓冲液洗涤3次后调整密度为5×106CFU/mL。利用探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)进行ROS检测，DCFH-DA可自由通过细胞膜进入细胞内被酯酶水解，而DCFH则不能透过细胞膜，从而使探针易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF荧光即可得知细胞内活性氧水平。按照试剂盒说明加入DCFH-DA试剂，37 ℃孵育20 min，流式细胞仪检测白念珠菌ROS水平[5]。

1.3.4白藜芦醇对白念珠菌MMP的影响 对指数生长期的白念珠菌悬液进行不同的加药处理后(同1.3.2)，孵育、离心收集白念珠菌细胞、PBS缓冲液洗涤、调整浓度同1.3.3。JC-1为检测MMP的荧光探针。当MMP较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物产生红色荧光；而MMP较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变(红色和绿色荧光强度的比值)可反映细胞膜电位的变化。参照MMP检测试剂盒说明书加入JC-1染色工作液，于细胞培养箱30 ℃避光孵育15 min后，PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测荧光强度[6]，然后计算。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0软件进行数据处理，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1白藜芦醇对白念珠菌细胞凋亡的影响 在0.064～0.256 mg/mL范围内，随着白藜芦醇浓度的升高，白念珠菌细胞凋亡率逐渐升高，见图1。

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

2.2白藜芦醇对白念珠菌ROS阳性率的影响 空白对照组的荧光强度弱，ROS阳性率为0.8%，不同浓度白藜芦醇(0.064、0.128、0.256 mg/mL)处理后，荧光强度呈剂量依赖性增强，ROS阳性率分别提升至1.9%、5.1%、8.7%和16.4%，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

2.3白藜芦醇对白念珠菌MMP的影响 与空白对照组比较，不同浓度(0.064、0.128、0.256 mg/mL)白藜芦醇可显著降低白念珠菌MMP，红色和绿色荧光强度比值分别为2.14、1.86、1.64(P<0.05)，见图3。

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

3 讨 论

3.1白藜芦醇诱导白念珠菌凋亡的机制 细胞凋亡是生物体普遍存在的现象——细胞自主有序的死亡过程，诱导细胞凋亡对真菌研究有重要意义。在所有诱导细胞凋亡的因素中，凋亡的早期表现之一为MMP的下降[7-8]。线粒体是真核细胞内能量产生的中心场所，对维持细胞能量代谢和正常功能起重要作用，诱发凋亡的因素会导致细胞色素C的释放激活caspase，破坏电子传递，降低MMP参与调节等[9]。若MMP耗尽，细胞将进入不可逆的凋亡转归途径[10]。在凋亡信号的刺激下，细胞凋亡导致一系列损伤相关的异质性分子的释放，如线粒体DNA、ROS、n-甲酰化肽及心磷脂，导致细胞通透性会增加[11-12]。作为酵母菌属细胞凋亡中的第二信使--不同水平的ROS决定了细胞的转归途径，包括凋亡、坏死、凋亡转变坏死等[13-14]。

坏死及凋亡细胞均释放具有炎症特性的线粒体，以往的研究表明白藜芦醇可通过阻滞细胞S期从而影响白念珠菌的活性[15]。本实验采用FCFH-DA和JC-1荧光试剂，检测白念珠菌ROS和MMP水平。白藜芦醇的作用机制可能与降低白念珠菌的MMP水平、提高ROS水平、扰乱线粒体功能等凋亡进展中与线粒体损伤有关的进程有关。

3.2白藜芦醇诱导白念珠菌凋亡的意义 白念珠菌常存在于人类上呼吸道、口腔、肠道及阴道等黏膜腔中，是临床上重要的条件致病菌[16-18]。临床上的治疗主要采用AmB及唑类抗真菌药物，其长期应用引起不良反应的报道日益增多[19]，因此寻找和发现新的药物以抑制白念珠菌的活性成为亟待解决的问题之一。白藜芦醇作为近年中药研究中的热点，其广泛的生物学活性受到关注。本研究中通过测定不同加药处理组白念珠菌的ROS、MMP水平，证实了白藜芦醇具有诱导白念珠菌凋亡的作用，中药成分诱导念珠菌属凋亡是当今抗真菌治疗的新策略，为临床治疗白念珠菌感染提供了重要的实验基础，具有潜在的应用价值。

3.3相关研究的比较 WEBER等[20]研究证明，白藜芦醇对于常见的念珠菌属并未有明显的抑制作用，而有报道指出白藜芦醇衍生物可能影响念珠菌属[21]。LEE等[3]的研究证实白藜芦醇可诱导白念珠菌的凋亡。

3.4本研究的局限性 本实验中选取白念珠菌ATCC90028的标准株作为研究对象，结果尚有代表性，但还需大样本的临床分离株及动物体内试验做进一步的证实；其次，在研究方法方面除了用流式细胞仪进行检测外，还应该结合其他分子水平的实验来对凋亡机制进行深入分析。

综上所述，白藜芦醇可以通过诱导细胞凋亡发挥对白念珠菌的抑制作用，为白藜芦醇用于临床治疗白念珠菌感染提供了有效的实验室依据，进一步丰富了中药抗真菌的理论，但其更深入的作用机制还有待进一步研究。