魏思宇,甘振丁,韦文耀,吴嘉敏,夏振海,陈璟玥,王恬,钟翔

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)

在现代化仔猪生产中,为提高生产效益,目前国内外广泛采用3～4周龄早期断奶的饲养方式[1]。由于仔猪消化道酶系统尚未发育完全,从吃母乳转为以饲料为主,将导致断奶应激等一系列生理变化,影响仔猪内源消化酶活性[2]和脾脏、胸腺、胰腺的抗氧化功能[3]。近年来,随着人们逐渐认识到抗生素的副作用,天然植物提取物作为饲用抗生素替代品应用于动物生产,俨然已成为一种研究趋势,同时也是国内外关注的热点。姜黄素(curcumin)是从姜科植物姜黄中提取的一种脂溶性多酚类活性物质,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基和抗微生物等多种药理活性[4]。白藜芦醇(resveratrol)是一种非黄酮类的多酚化合物,具有抗氧化、抗应激、免疫调节、抑癌、改善胃肠道损伤的作用[5]。已有研究表明,日粮中添加姜黄素能缓解胎儿宫内生长迟缓(IUGR)诱导的仔猪肠道氧化应激,降低过氧化物的堆积,缓解免疫应激对仔猪肠道的损伤[6-7]。在肉鸡日粮中添加姜黄素可提高血清的抗氧化能力[8]。在大鼠饲粮中加入5 g·kg-1姜黄素,胰酶活性显著增强[9]。也有研究表明,日粮中添加白藜芦醇能提高肌肉的抗氧化能力,预防肉鸡运输过程中产生的应激性肉质受损[10]。在生长育肥猪的饲粮中添加白藜芦醇可调节肠道菌群,增强机体抗氧化能力,改善肠道健康[11]。最新研究发现饲粮中联合添加白藜芦醇和姜黄素能高断奶仔猪的生长性能[12]。然而,目前关于姜黄素和白藜芦醇对消化酶影响的研究仍然很少,这两者的抗氧化能力在断奶仔猪上的应用研究也少见报道。本试验旨在通过研究姜黄素与白藜芦醇联合作用下断奶仔猪消化酶的变化以及胰腺抗氧化功能的影响,寻求一种新型、安全、绿色的饲料添加剂,为养猪业健康生产提供试验依据和物质基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

动物和试验设计经南京农业大学动物保护和使用委员会批准(NJAU-CAST-2015-098)。选取日龄为(28±2)d断奶的杜×长×大仔猪180头(公母各半),平均体质量(7.8±0.6)kg,随机分成6组,每组3个重复,每个重复10只,试验期为28 d。将所有猪圈养在(25.0±0.5)℃的圈舍中,自由采食和饮水。6个组的日粮配制:基础日粮(CON组)、基础日粮+159 mg·kg-1喹乙醇+81 mg·kg-1吉他霉素+60 mg·kg-1金霉素(ANT组)、基础日粮+300 mg·kg-1白藜芦醇+300 mg·kg-1姜黄素(HRC组)、基础日粮+100 mg·kg-1白藜芦醇+100 mg·kg-1姜黄素(LRC组)、基础日粮+300 mg·kg-1白藜芦醇(RES组)、基础日粮+300 mg·kg-1姜黄素(CUR组)。

1.2 试验日粮

参照NRC(2012)配制基础日粮。配方及营养成分见表1。姜黄素(含量大于98%)来自科虎生物技术研究中心;白藜芦醇(含量大于98%)来自上海西宝生物技术有限公司。姜黄素和白藜芦醇贮存在避光容器中,每2 d补充1次新鲜的饲料。

表1 基础日粮组成及营养组成水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.3 样品采集

当仔猪饲养到56日龄时,在每个重复中随机选择2只仔猪,腹腔注射戊巴比妥纳溶液后,放血致死。之后迅速剖开腹腔,取出从幽门括约肌到回盲瓣的整个小肠,小心挤出空肠及回肠中段食糜约2 g,保存于无菌冻存管;小心剥离胰腺组织,分装于无菌冻存管。以上均立即放入液氮速冻后,保存在-80 ℃冰箱。

1.4 检测指标

1.4.1 小肠、胰腺消化酶活性的测定取空肠和回肠食糜及胰腺组织按照质量(g)∶体积(mL)为1∶4的比例制备20%组织匀浆液,于4 ℃、4 000 r·min-1条件下离心15 min,分离上清液待测。参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书测定空肠、回肠食糜和胰腺组织中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。

1.4.2 胰腺组织抗氧化指标的测定从-80 ℃冰箱中取出200 mg胰腺组织,制备成20%组织匀浆液。于4 ℃、4 000 r·min-1条件下离心15 min,分离上清液待测。超氧化物歧化酶1(SOD1)活性采用黄嘌呤氧化酶法测定,丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用2-硝基苯甲酸法测定,还原型谷胱甘肽(GSH)含量采用二硫代二硝基苯甲酸比色法测定。所有指标均参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书,严格按照测定步骤进行。

1.4.3 胰腺RNA的提取和qPCR法检测胰腺mRNA的表达从-80 ℃冰箱中取出冻存的样品,取胰腺组织样品80 mg,按照RNAiso提取试剂盒(TaKaRa,大连)说明书的步骤提取RNA。采用Thermo Nano Drop 2 000超微量可见光分光光度计测定所提取的RNA浓度和纯度。按照TaKaRa试剂盒说明书,采用20 μL反转录体系,反转录所得cDNA于-20 ℃保存备用。使用SYBRPremixExTaq试剂盒(TaKaRa)进行qPCR反应。反应体系如下:SYBR 10 μL、上游和下游引物各0.4 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、cDNA 2 μL、超纯水 6.8 μL。试验反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,40个循环。熔解曲线反应:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。所用基因引物由上海生工生物公司设计并合成。各基因相对表达量以2-ΔΔCT计算,以β-actin为内参基因。引物序列见表2。

表2 实时荧光定量PCR(qPCR)所用引物序列Table 2 Primer sequences used in quantitative real time PCR

1.5 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪消化酶活性的影响

由表3可以看出:与CON组相比,HRC、LRC、RES、CUR组空肠中淀粉酶活性均显著上升(P<0.05),分别提高21.19%、19.64%、19.35%、18.03%,糜蛋白酶活性也显著上升(P<0.05),分别提高44.60%、36.71%、36.52%、28.52%;回肠RES组胰蛋白酶活性有显著变化(P<0.05),HRC、LRC、CUR组糜蛋白酶活性显著增加31.75%、28.35%、26.33%(P<0.05);胰腺仅RES组的糜蛋白酶活性差异显著(P<0.05)。添加姜黄素与白藜芦醇的4组同ANT组相比,HRC、LRC、CUR组胰腺淀粉酶活性显著降低(P<0.05),胰蛋白酶活性无显著差异(P>0.05),脂肪酶和糜蛋白酶仅RES组差异显著(P<0.05);空肠的淀粉酶和糜蛋白酶活性均显著提高(P<0.05),HRC、RES组胰蛋白酶活性差异显著(P<0.05),脂肪酶活性无显著差异(P>0.05);回肠的淀粉酶和脂肪酶活性无显著差异(P>0.05);HRC、LRC、CUR组胰蛋白酶活性和HRC、LRC、RES组糜蛋白酶活性均差异显著(P<0.05)。以上结果说明,白藜芦醇与姜黄素可影响断奶仔猪体内消化酶活性。

表3 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪胰腺(P)、空肠(J)、回肠(I)消化酶活性的影响Table 3 Effects of resveratrol and curcumin on digestive enzyme activities of pancreatic(P),

2)同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05). The same as below.

2.2 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪胰腺抗氧化指标的影响

由表4可知:与CON组相比,HRC、LRC、RES和CUR组SOD1活性显著降低(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.05),而GSH含量与GSH-Px活性显著升高。与ANT组相比,HRC、LRC和RES组SOD1活性和MDA含量显著降低(P<0.05);GSH含量仅RES组差异显著(P<0.05);GSH-Px活性与HRC、LRC、RES、CUR组均有显著性差异(P<0.05)。以上结果说明,白藜芦醇与姜黄素可影响断奶仔猪胰腺的抗氧化能力。

表4 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪胰腺抗氧化指标的影响Table 4 Effects of resveratrol and curcumin on pancreatic antioxidant parameter in weaned piglets

2.3 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪胰腺mRNA相对表达量的影响

由表5可知:与CON组相比,HRC组的SOD1和血红素加氧酶1(HO-1)mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),HRC和LRC组的GSH-Px和过氧化氢酶(CAT)mRNA相对表达量也显著提高(P<0.05)。与ANT组相比,HRC、LRC、RES和CUR组GSH-Px和HO-1mRNA的相对表达量均无显著差异(P>0.05),CUR组SOD1mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),LRC、RES和CUR组CATmRNA相对表达量均显著下降(P<0.05)。

表5 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪胰腺抗氧化基因mRNA表达水平的影响Table 5 Effect of resveratrol and curcumin on expression level of anti-oxidation gene mRNA in pancreas of weaned piglets

3 讨论

3.1 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪消化酶活性的影响

胰腺和小肠是分泌消化酶的主要场所,两者分泌的内源消化酶活性会直接影响消化系统对营养物质的消化吸收能力。周芬等[2]研究发现由断奶引起的空肠淀粉酶活性降低持续时间较长,张宏福等[13]报道越早断奶,糜蛋白酶在空肠和回肠的活性降低后恢复正常水平的时间越长。断奶后由于胃肠道结构尚未发育完全,肠道微生态还未建立正常的运行系统,酶活性的增长将被显著抑制[14]。断奶后2周仔猪胃肠道微生物区系才恢复[15],而部分胰酶活性仍然维持在断奶时水平[16],因此提高内源消化酶活性对解决仔猪断奶后应激导致的生长停滞具有重要意义。Gan等[12]报道,添加姜黄素和白藜芦醇后断奶仔猪的平均日增重、平均每日采食量均显著增加,说明两者能够提高断奶仔猪的生长性能。已有研究通过色谱法检测白藜芦醇代谢产物在猪体内的分布,发现白藜芦醇在小肠的代谢物含量较多,而在其余组织中的分布少[17]。Song等[18]利用色谱法检测施用Protandim后大鼠组织中姜黄素的积累,发现也有类似结论。说明两者发挥作用的主要场所在小肠。本试验结果表明,与对照组相比,胰腺中除白藜芦醇组糜蛋白酶活性显著提高外,其余各组的消化酶活性并无显著变化;而在空肠中,淀粉酶、糜蛋白酶以及回肠的糜蛋白酶活性则在添加姜黄素或白藜芦醇之后有显著变化。以上结果表明,白藜芦醇和姜黄素有提高小肠中消化酶活性的能力,但对胰腺胰酶活性的影响不大。我们推测,白藜芦醇和姜黄素可能通过以下2个方式调节小肠的消化酶活性:一是,断奶应激除了对消化酶活性有影响,也会导致小肠结构例如肠绒毛萎缩、隐窝增生、肠黏膜屏障损坏等变化。荀文娟等[19]研究发现饲粮中添加姜黄素可显著提高断奶仔猪回肠绒毛高度,降低回肠绒毛宽度和隐窝深度。王改[20]研究发现,姜黄素可改善肠黏膜屏障功能受损。Donald等[21]研究发现,白藜芦醇可以减轻胃肠黏膜、隐窝和肌层的损伤。由于小肠内消化酶主要来自胰腺和小肠黏膜上皮细胞,推测白藜芦醇与姜黄素可能通过修复肠黏膜,改变小肠的形态和改善小肠环境从而影响消化酶的分泌和断奶仔猪体内消化酶活性。二是,断奶应激也会影响肠道微生物区系,而肠道微生物在宿主健康中发挥着重要作用,与营养物质的消化吸收密切相关[22]。与抗生素相比,姜黄素和白藜芦醇也有一定抑菌能力[23-24]。另有研究表明姜黄素和白藜芦醇可增加乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的数量,促进养分吸收[25]。本试验发现,与抗生素组相比,添加白藜芦醇和姜黄素组总体小肠消化酶活性明显更高,说明两者某种程度上可能通过影响肠道微生物而改善肠道微生态环境和增强消化酶的活性,并且可达到替代抗生素的效果,甚至更优。总之,添加姜黄素和白藜芦醇能影响肠道消化酶的活性,但其具体的影响机制还有待进一步探究。

3.2 白藜芦醇和姜黄素对断奶仔猪胰腺抗氧化酶活性的影响

动物机体在正常生理条件下,体内的氧化系统与抗氧化系统处于一种动态平衡,从而保障机体细胞内外环境的稳定以及生理机能正常。在氧化应激条件下,由于大量活性氧(ROS)堆积,超过了机体抗氧化能力,最终导致体内抗氧化系统平衡被破坏[26]。酶抗氧化系统包括SOD、CAT、GSH-Px等,而SOD1是SOD的亚型。有研究表明氧化鱼油处理下仔猪断奶后肝脏中SOD和GSH-Px的活性明显下降,肝脏和血浆中MDA含量提高[27],表明仔猪在断奶应激下体内氧自由基升高,脂质过氧化产物堆积。试验表明白藜芦醇和姜黄素具有抗氧化作用,可以提高组织中SOD活性水平[28-29]。本试验研究结果显示添加白藜芦醇和姜黄素的4组SOD1活性均降低,与上述结果不同,推测是因为SOD1的负调控机制发挥作用导致SOD1活性下降。分析原因:SOD1一方面可以将超氧自由基转化为分子氧和过氧化氢,维持胞内ROS的内稳态从而缓解氧化应激;另一方面特异性抑制SOD1调控癌细胞内ROS水平[30],ROS作为信号分子介导细胞信号转导作用于线粒体,诱发细胞凋亡抑制癌细胞的生长。白藜芦醇与姜黄素均有抑制癌细胞增殖的作用,并且研究发现姜黄素和白藜芦醇诱导细胞凋亡的机制可能是通过促氧化发挥抗癌作用,即增加ROS的产生,造成线粒体氧化损伤[31-32]。Bujanda等[33]发现经过白藜芦醇治疗非酒精性脂肪肝的大鼠,其MDA水平降低的同时伴有GSH-Px活性显著增加。赵春萍等[34]试验发现日粮中添加姜黄素,断奶仔猪血清中MDA含量降低,GSH-Px活性升高。矫春丽等[35]研究CCl4致小鼠急性肝损伤模型中,添加姜黄素类化合物组小鼠的GSH水平均明显升高。从本试验中发现,在白藜芦醇和姜黄素作用下,胰腺中MDA含量显著下降,GSH含量和GSH-Px活性均显著升高,与上述试验结果一致。由此判断白藜芦醇联合姜黄素能够提高胰腺中抗氧化酶活性,消除自由基,缓解脂质过氧化反应,调节由氧化应激造成的断奶仔猪胰腺细胞损伤,从而保护胰腺。总体来看,白藜芦醇和姜黄素能够在断奶仔猪的胰腺组织中发挥抗氧化作用。

3.3 白藜芦醇联合姜黄素对断奶仔猪胰腺抗氧化相关基因表达水平的影响

本试验结果显示,饲粮中添加姜黄素和白藜芦醇之后,断奶仔猪胰腺的抗氧化相关基因mRNA表达水平升高。添加姜黄素和白藜芦醇组胰腺SOD1基因表达水平明显上升,说明姜黄素和白藜芦醇确实上调了SOD1的表达。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是机体抗氧化应激的中枢调节者,当其在体内被有毒有害物质激活后进入细胞核与抗氧化反应元件结合形成Nrf2-ARE信号通路,使下游一系列起到保护机体的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因及蛋白表达[36]。HO-1是该通路中发挥功能的主要酶,可以在体内中和过量的亚铁血红素[37],从而在一定程度上缓解机体的氧化应激。另外,Nrf2-ARE信号通路也可以促进CAT、GSH-Px的分泌,CAT可以清除体内的过氧化氢,使细胞避免H2O2的影响。Shen等[38]发现姜黄素通过调控Nrf2-ARE信号通路,诱导机体产生HO-1来保护大鼠肝组织。王冠[39]研究发现白藜芦醇明显增加Nrf2的表达和转录活性,并且增加下游抗氧化基因HO-1的表达量。本试验结果表明,HRC组HO-1mRNA表达水平显著提高,与上述试验结果一致,因此推测合理添加白藜芦醇和姜黄素可以诱导HO-1mRNA表达以改善胰腺氧化应激损伤。Liu等[40]发现饲粮中添加白藜芦醇可显著增强雪峰乌骨鸡血清中CAT活性,缓解热应激。王斐等[6]报道添加姜黄素能够显著提高仔猪肠道CAT的活性。本试验结果显示,与对照组相比,HRC和LRC组胰腺CATmRNA表达量明显升高,说明白藜芦醇与姜黄素可能通过刺激mRNA表达上调该抗氧化酶的活性。本试验研究结果显示HRC和LRC组胰腺GSH-PxmRNA表达量明显提高,与该酶活性变化一致。进一步分析姜黄素和白藜芦醇发挥抗氧化的机制可能是通过调控Nrf2-ARE信号通路,促使相关基因的表达,影响抗氧化酶活性,进而提高断奶仔猪胰腺抗氧化能力。

综合上述胰腺抗氧化酶活性和抗氧化基因mRNA表达水平的变化,发现:1)LRC与RES、CUR组相比,胰腺中MDA和GSH含量、SOD1和GSH-Px活性及其基因表达水平并无显著性差异,说明低剂量的姜黄素和白藜芦醇联用,可以达到高剂量单独添加姜黄素或白藜芦醇的水平。推测其原因是白藜芦醇可以介导血浆中的蛋白质氧化,具有改善氧化应激作用[41],而姜黄素能够在体内共价修饰细胞蛋白质形成姜黄素蛋白质加合物,有助于姜黄素的吸收作用[42-43],所以白藜芦醇可以促进姜黄素的吸收。2)HRC和LRC组相比,高剂量联合使用的效果明显优于低剂量联合使用,但是本试验只是探究300 mg·kg-1与100 mg·kg-1的联合剂量,中间剂量尚未涉及,因此最佳的联合剂量尚不清楚。考虑生产成本和经济效益,选用低剂量姜黄素和白藜芦醇联用是否能达到更好的作用效果,值得进一步探索。

综上,饲粮中添加白藜芦醇和姜黄素能够提高断奶仔猪体内小肠消化酶活性,提高胰腺中抗氧化酶活性和调节抗氧化酶相关基因的表达,进而影响断奶仔猪胰腺抗氧化能力,改善仔猪因断奶造成的应激损伤。且姜黄素和白藜芦醇低剂量联用可以达到单独添加高剂量的效果,此结论可以为畜牧临床应用姜黄素和白藜芦醇提供一定参考。本结果还提示姜黄素和白藜芦醇具有抗生素的替代潜力。