刘想忠　宁宇　胡静　杨傲飞　蔡寒涛　李章华

[摘要] 目的 探讨极度低氧条件下Ckip-1 siRNA促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用。 方法 差速贴壁法分离培养兔BMSCs，常氧（20%）及极度低氧（1%）条件下培养72 h，实时荧光定量PCR（qPCR）及Western blot检测成骨基因Run相关转录因子2（Runx2）、SMAD5及骨形态发生蛋白2（BMP2）表达，培养3、5、7 d后检测上清中碱性磷酸酶（ALP）活性。再将BMSCs置于1%氧浓度下培养72 h，观察Ckip-1 siRNA对Runx2、SMAD5及BMP2表达及ALP活性的影响。 结果 1%氧浓度下BMSCs的成骨基因表达及ALP活性明显低于20%氧浓度下，差异有统计学意义（P < 0.05）;Ckip-1 siRNA转染后BMSCs成骨基因表达及ALP活性明显高于未转染，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 极度低氧可抑制BMSCs成骨分化能力，而Ckip-1 siRNA促进BMSCs在极度低氧条件下向成骨细胞分化。

[关键词] 低氧;Ckip-1 siRNA;骨髓间充质干细胞;成骨分化

[中图分类号] R331.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（c）-0010-06

[Abstract] Objective To investigate the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） by Ckip-1 siRNA under extreme hypoxia. Methods BMSCs were isolated and cultured in normal oxygen （20%） and extreme hypoxia （1%） for 72 h. The expression of osteogenic gene Runt-related transcription factor 2 （Runx2）， Smad5 and bone morphogenetic protein 2 （BMP2） were detected by real-time quantitative PCR （qPCR） and Western blot. Alkaline phosphatase （ALP） activity in the supernatant was detected after 3， 5， 7 days of culture. BMSCs were cultured in 1% oxygen for 72 h to observe the effect of Ckip-1 siRNA on the expression of Runx2， Smad5， BMP2 and the activity of ALP. Results The osteogenic gene expression and ALP activity of BMSCs in 1% oxygen concentration were significantly lower than those in 20% oxygen concentration group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）; the osteogenic gene expression and ALP activity of BMSCs after transfection with Ckip-1 siRNA were significantly higher than those without transfection， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Hypoxia can inhibit the osteogenic differentiation of BMSCs， and Ckip-1 siRNA can promote the differentiation of BMSCs into osteoblasts.

[Key words] Hypoxia; Ckip-1 siRNA; Bone marrow derived mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation

骨髓間充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种多能干细胞，其在常氧下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等，且易于培养。因此，在干细胞移植方面具有广阔的应用前景[1-2]。然而，发生骨折或股骨头坏死时，局部往往形成缺血缺氧环境，可使局部氧浓度降至1%～2%，甚至更低[3-5]。BMSCs作为种子细胞，其移植后在低氧条件下生物学特性的维持是影响疗效的关键。目前，关于在低氧条件下干细胞的成骨分化能力尚存在争议，多数学者认为极度低氧可抑制BMSCs成骨分化能力[6]。酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（casein kinase 2 interaction protein 1，Ckip-1）是近些年发现的一种负性调控蛋白，可抑制Run相关转录因子2（Runx2）等成骨基因的表达而起到成骨抑制作用，敲低其在细胞内的表达，可一定程度上促进干细胞的成骨能力[7-8]。本研究拟观察敲低BMSCs中Ckip-1表达是否可增强BMSCs在极度低氧环境下的成骨分化能力，为后期应用Ckip-1治疗股骨头坏死提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

MSCM专用培养基（Sciencell公司，美国）;RNA提取试剂盒（OMEGA公司，美国）;逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（TOYOBO公司，日本）;引物均由上海生工合成;Ckip-1 siRNA由苏州贝信公司合成;LipofectaminTM 2000（Invitrogen公司）;成骨诱导液（Cyagen公司，日本）;碱性磷酸酶ALP检测试剂盒（大连Meilunbio公司）;Runx2兔抗鼠单克隆抗体（Abcam公司，美国）;SMAD5兔单克隆抗体（NOVUS，美国）;BMP2兔单克隆抗体（Bioss公司）。CO2培养箱（Thermal，美国，184L）;qPCR仪器（BIORAD，美国，CFX96）;倒置相差显微镜（Leica，德国，SP8-STED）;酶联免疫检测仪（Molecular，美国，ELX800）;低温离心机（SCILOGEX，美国，D3024）。

1.2 实验方法

1.2.1 兔BMSCs原代细胞提取、培养与鉴定  取成年新西兰兔4月龄，雌雄不限，按实验室之前方法提取、培养与鉴定BMSCs[9]。

不同氧浓度下细胞的培养：将第3代BMSCs接种于6孔板，分为20%氧浓度组及1%氧浓度组，待贴壁后，将MSCM培养基更换为成骨诱导液2 mL，转至含37℃、5%CO2、氧浓度分别为20%及1%的培养箱中培养3、5、7 d。

Ckip-1 siRNA转染及培养：对第3代BMSCs进行Ckip-1 siRNA转染，分为空白组、阴性对照组及Ckip-1 siRNA组，Ckip-1 siRNA终浓度为50 pmol/mL，1%氧浓度条件下培养3、5、7 d。

1.2.2 ALP活性检测  细胞培养完成后收集上清，根据ALP试剂盒说明，设置空白孔、标准孔及样品孔，以510 nm波长检测吸光度，计算公式：ALP活性（金氏单位/100 mL）=（测量的OD值-空白孔OD值）/（标准孔OD值-空白孔OD值）。

1.2.3 成骨基因mRNA表达检测  细胞培养完成后，PBS洗涤收集细胞，按1×106个细胞加1 ml Trizol Reagent 进行总RNA提取，紫外分光光度仪测定纯度A260/A280比值为1.80～1.90，定量，各取1 μg RNA进行逆转录获取cDNA。引物设计：按照NCBI GENE查询的Runx2、SMAD5、BMP2及GAPDH基因序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Runx2引物序列：上游5′-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3′，下游5′-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3′;GAPDH引物序列：上游5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′;Smad5引物序列：上游5′-TGCCTATATGCCACCTGAT′，下游：5′-CTGAACATCTCTGCTGGATAT-3′;BMP2引物序列：上游5′-TGCACCCAGATGAACACAGC-3′，下游5′-TCCGCTGTTTGTGTTTCGCT-3′;qPCR反應体系为20 μL，包含10 μL的SYBRMIX，1 μL的上下游引物混合液及1 μL cDNA，加入DEPC水补至20 μL，以GAPDH为内参。反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，72℃退火15 s，60℃延伸15 s，39个循环后检测溶解曲线。

1.2.4 Western blot检测成骨基因蛋白表达  细胞培养完成后，PBS洗涤两次收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液，0℃裂解30 min，半径为20 cm的低温离心机12 000 r/min离心15 min后，取上清，BCA法检测蛋白浓度。上清加入蛋白上样缓冲液于100℃变性5 min。配置10%分离胶及浓缩胶，行SDS-PAGE电泳，200 mA恒流电转至PVDF膜。脱脂奶粉配置5%封闭液，封闭60 min，以GAPDH蛋白为内参，分别加入GAPDH抗体、Runx2抗体、Smad5抗体及BMP2抗体，4℃孵育过夜。二抗室温孵育1 h。超敏ECL试剂盒反应后，在Biorad化学发光系统显影。

1.2.5 检测Ckip-1 siRNA对BMSCs细胞Ckip-1基因的沉默作用  将第3代BMSCs均匀种植于6孔板中，贴壁后进行siRNA转染，分为空白组、阴性对照组及Ckip-1 siRNA组，用无血清DMEM稀释siRNA、Negative control及Lipo2000，根据siRNA说明书以10、20、50 pmol/mL的Ckip-1 siRNA终浓度进行转染，1%氧浓度培养72 h。qPCR检测Ckip-1的表达。Ckip-1引物物序列：上游引物5′-TGCTGGGAGAG-GCGTCATCG-3′，下游引物5′-GCTCTTGCGGTACT-GGCTGTG-3′。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验;计数资料以频数、构成比表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs形态学观察

BMSCs贴壁后呈梭形、多角形，随着培养时间延长，出现克隆式生长，呈长梭形。在低倍镜下呈紧密排列的旋涡状生长（图1A），在高倍镜下呈长梭形、成纤维细胞样生长（图1B）。见图1。

2.2 不同氧浓度下成骨基因表达

2.2.1 ALP活性检测  1%氧浓度组培养3、5、7 d细胞ALP活性明显低于20%氧浓度组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2.2 不同氧浓度下成骨基因mRNA表达比较  培养细胞72 h后。qPCR结果显示：1%氧浓度组细胞成骨基因Runx2、SMAD5及BMP2的表达均低于20%氧浓度组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.2.3 不同氧浓度下成骨基因蛋白表达比较  培养细胞72 h后，Western blot检测结果显示：1%氧浓度组细胞成骨基因蛋白表达明显低于20%氧浓度组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.3 Ckip-1 siRNA对BMSCs的沉默作用

Ckip-1 siRNA转染72 h后，qPCR结果显示：10、20、50 pmol/mL Ckip-1 siRNA组中Ckip-1的表达量均低于空白组，差异有统计学意义（P < 0.05）;在50 pmol/mL时最低，50 pmol/mL组Ckip-1的表达量明显低于20 pmol/mL組，差异有统计学意义（P < 0.05）。因此后续实验取50 pmol/mL为最终浓度。见图4。

2.4 在1%氧条件下Ckip-1 siRNA对BMSCs成骨基因表达的影响

2.4.1 ALP活性检测  在不同时间段，Ckip-1 siRNA组上清中ALP活性均高于空白组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.4.2 Ckip-1 siRNA对BMSCs成骨基因mRNA表达的影响  培养细胞72 h后，qPCR结果显示：1%氧条件下，Ckip-1 siRNA组细胞成骨基因Runx2、SMAD5及BMP2 mRNA表达均高于空白组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图5。

2.4.3 Ckip-1 siRNA对BMSCs成骨基因蛋白表达的影响  培养细胞72 h后，Western blot检测结果显示：Ckip-sRNA组细胞成骨基因蛋白表达明显高于空白组，差异差异有统计学意义（P < 0.05）。见图6。

3 讨论

BMSCs作为多能干细胞，在组织工程中的应用具有重要地位。体外培养BMSCs大多数是在常氧环境下进行，然而在体内很多部位氧浓度较低，如软骨或关节部位氧浓度一般在6%～10%，深部关节更是可达1%，发生大面积骨缺损及股骨头坏死等疾病时，氧浓度还可降至更低水平[10-11]。进行外源性干细胞移植治疗这类疾病时，干细胞将面临严重的缺血缺氧、营养因子缺乏等一系列问题，因此，提高BMSCs在低氧环境中的存活能力并维持成骨特性非常重要。尽管对低氧状态下干细胞的研究较多，但对BMSCs在低氧下的生物学特性仍未达成共识。研究显示[12-13]，低氧可诱导干细胞高表达低氧诱导因子，激活血管内皮生长因子表达，促进其成血管能力。胡旭治等[14]通过低氧剂CoCl2建立低氧模型，发现BMSCs的成骨基因蛋白表达明显上调。罗芸等[15]通过比较20%、10%及5%氧浓度下充质干细胞的生物学特性发现，5%氧条件下对细胞除具有抗凋亡作用外，还有成神经诱导能力。Holzwarth等[16]在研究中发现充质干细胞由常氧转移至1%氧浓度后，其生长多停滞在G1期，成骨及成脂分化能力均减弱，但由1%氧浓度恢复至3%氧浓度时，则成骨分化能力有所提高。ALP是细胞成骨分化的早期指标，与细胞成骨能力有关[17]。本研究中，BMSCs在1%氧浓度下培养3、5、7 d后，上清中ALP活性明显低于20%氧浓度，且各项成骨蛋白Runx2、SMAD5及BMP2的表达量均较20%氧浓度低。

为改善BMSCs在低氧环境下的耐受能力，廖红兴等[18]将载有骨形态发生蛋白6及低氧诱导因子1a的腺病毒转染入干细胞内，并在2%氧浓度下培养，结果发现，与对照组比较，实验组血管及成骨能力均明显增强。王梓豪等[19]研究显示，过表达GATA-4-BMSCs可以通过增强BMSCs抗凋亡能力，有效改善小鼠心肌梗死后的心功能。提示通过对干细胞进行干预可促进其成骨分化能力。

Ckip-1对MSCs的调节作用近年来受到人们的广泛关注，作为骨负性调节因子，Ckip-1的C末端结构域可以与Smurf1两个WW结构域之间的连接区发生相互作用以激活Smurf1因子，进而激活泛素-蛋白酶降解系统，降解Runx2、BMP2等成骨基因表达，抑制体内成骨，引起骨质疏松[20-22]。通过不同方式干扰Ckip-1的表达，可一定程度上促进干细胞成骨，如陈俊凤等[23]通过使干细胞的microRNA-20a过表达后，发现可抑制Ckip-1表达，进而促进成骨基因表达。或者通过其特异性siRNA，也可降低Ckip-1表达，在体内可增加骨量及骨小梁体积。在体外，还可抑制BMSCS凋亡，而促进成骨能力，提高骨钙素表达[24]。然而，目前关于Ckip-1对充质干细胞的研究多是在常氧条件下进行的，在低氧环境下是否仍具有同样作用，研究较少。本研究在极度低氧环境下敲低BMSCs内Ckip-1表达，以探索是否在低氧环境下Ckip-1 siRNA仍有促成骨能力，为改善BMSCs在极度缺氧环境中的成骨能力寻找新方法。本研究首先验证了低氧环境下Ckip-1 siRNA的特异性干扰作用，结果显示随着浓度的提高，Ckip-1 siRNA的抑制作用更加明显。故本研究选取最高浓度50 pmol/mL作为实验浓度，结果显示，转染Ckip-1 siRNA后，BMSCs的成骨基因表达明显上调，提示在极度低氧条件下，BMSC转入Ckip-1 siRNA后成骨能力明显提高。

综上所述，在极度低氧条件下，BMSCs的成骨分化能力明显受抑制，通过转染Ckip-1 siRNA降低Ckip-1的表达，可一定程度上提高BMSCs的成骨能力。这提示，当对骨折或股骨头坏死等局部引起极度缺氧疾病进行干细胞移植时，通过抑制Ckip-1表达，可在一定程度上改善BMSCs的成骨能力。

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（收稿日期：2020-02-06  本文編辑：刘永巧）