王 建，邵 园，张印南，李 慧，朱 俊，许崇涛

（1.深圳市康宁医院//深圳市精神卫生中心，广东 深圳 518000；2.汕头大学精神卫生中心，广东 汕头 515041）

睡眠剥夺是目前抗抑郁治疗起效最快的方法之一[1]，但具体作用机制尚不明确。海马作为皮质边缘系统的重要组成部分，与学习、情感、应激反应等脑功能有密切的联系，抑郁症的发生及抗抑郁治疗机制方面的研究重点已经聚焦到了海马。近年来有学者提出了抑郁症的“神经营养因子假说”[2]，认为抑郁是由于海马区神经营养因子水平降低导致神经元萎缩，海马神经发生降低及胶质细胞缺失；而抗抑郁治疗能够阻断或者反转神经营养因子的缺失，进而反转细胞的萎缩和缺失。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）作为神经营养因子中的重要一员，在海马区高表达，对神经胶质细胞、多巴胺能、血清素能、去甲肾上腺素能神经元的生长和维护能产生广泛的神经营养作用。有文献[3]报道大鼠在慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS） 后，海马区GDNF的表达降低，而应用抗抑郁药治疗则会恢复GDNF的正常表达。故本研究选取海马区GDNF作为研究点，首次在CUMS诱导的抑郁大鼠模型上，观察快速眼动睡眠剥夺（rapid eye movement sleep deprivation，REMSD）对大鼠行为学及海马区GDNF表达的影响，进一步探索睡眠剥夺快速抗抑郁效应的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

18只成年雄性SD大鼠由汕头大学医学院动物实验中心提供，体质量220～300 g，SPF级。动物房通风良好，室温控制在22℃，自然光照，自由进食、饮水。适应1周后正式开始实验。

1.2 主要试剂

GDNF抗体（sc-328）购自美国Santa Cruz公司，β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、超敏ECL化学发光试剂盒BeyoECL Plus均购自江苏碧云天生物技术有限公司，RIPA Buffer（9806s）购自美国Cell Signaling公司，蛋白酶抑制剂（5892970001-1）购自瑞士Roche公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Pierce公司，PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 实验大鼠随机分为正常对照组、应激造模组和REMSD组，每组6只。对所有大鼠进行首次开场实验。然后应激组和REMSD组给予连续28 d CUMS，再对所有大鼠进行第2次开场实验。随后REMSD组进行连续72 h REMSD，最后对所有大鼠进行第3次开场实验。断头取海马，采用蛋白质印迹法检测各组大鼠海马区GDNF的表达。

1.3.2 CUMS模型制备 参照本研究组既往研究方法[4]，将禁食24 h、禁水24 h、夹尾1 min、行为束缚限制2 h、4℃冰水游泳5 min、明暗颠倒24 h、鼠笼倾斜45°24 h、潮湿垫料10 h、空瓶放置5 h、40℃高温环境中振荡10 min、电击足底（电流强度1.0 mA，每次持续1 s，6次/min，共10 min）共11种刺激随机安排到28 d内，每种刺激平均出现2～3次，同种刺激不能连续出现，每日1种刺激，使大鼠不能预料刺激的发生。

1.3.3 REMSD模型建立 采用小平台水环境法，选用长36 cm、宽32 cm、高30 cm的塑料水槽，其中放置1个直径6.3 cm、高8.0 cm的平台，在平台周边注满水，水面距平台面约1.0 cm，大鼠在平台上可自行饮食、饮水，水温保持在22℃左右。当大鼠进入快眼动睡眠时，由于全身肌张力降低，节律性地垂头触水或落入水中而觉醒，从而使大鼠始终不能进入快速眼动睡眠。

1.3.4 开场实验 应用DigBehv动物自发活动行为视频跟踪分析系统（上海移数信息科技有限公司）检测，观察箱长×宽×高为50 cm×50 cm×65 cm，房间隔音、隔光，15:00～17:00在黑暗的观察箱内进行实验，每只大鼠观察时间5 min。动物的活动情况通过红外摄像系统和视频合成器，由计算机记录大鼠的运动轨迹，分析总路程、中央区活动路程的改变。在应激前、应激后及72 h REMSD后共测定大鼠的自发活动3次。

1.3.5 蛋白质印迹法检测大鼠海马区GDNF的表达 取大鼠脑组织，加入RIPA裂解液，冰上研磨成匀浆，4℃、12 000 r/min离心5 min。BCA法测定蛋白含量。取100 μg总蛋白，5%～12%SDSPAGE电泳分离后转移到PVDF膜，室温封闭2 h后加入相应一抗，孵育过夜。然后再加入相应二抗，室温孵育2 h。ECL化学发光显影定影。

1.4 统计学方法

采用EXCEL 2003和SPSS 13.0统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD（通过齐性检验）和非参数检验（未通过齐性检验），自身前后比较采用配对t检验，两样本均数比较采用独立样本t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 应激和REMSD对大鼠开场实验自发活动的影响

各组大鼠在应激前活动路程差异均无统计学意义（P＞0.05）。应激后与正常对照组相比，应激造模组和REMSD组大鼠的总路程、中央路程均降低（P＜0.01），表明大鼠经过28 d CUMS后出现抑郁样行为。REMSD组第3次开场实验和第2次开场实验相比，总路程、中央路程均增加（P＜0.01），表明REMSD改善了大鼠的抑郁样状态。见表1。

2.2 应激和REMSD对大鼠海马区GDNF表达的影响

应激造模组大鼠海马区GDNF表达水平较正常对照组降低（P＜0.01）；REMSD组大鼠海马区GDNF表达水平较正常对照组降低（P＜0.05），但与应激造模组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

表1 大鼠自发活动开场实验 （m，±s）

表1 大鼠自发活动开场实验 （m，±s）

1）与正常对照组相比，P＜0.01；2）与REMSD组第2次实验结果相比，P＜0.01；3）与应激造模组相比，P＜0.01。

组别正常对照组（n=6）应激造模组（n=6）REMSD组（n=6）第1次总路程20.80±1.62 20.49±1.81 20.97±1.44中央路程1.79±0.26 1.87±0.32 1.84±0.30第2次总路程19.44±2.48 5.32±1.541）5.12±1.721）中央路程1.79±0.31 0.54±0.281）0.55±0.211）第3次总路程21.01±2.02 5.18±1.431）21.24±1.902） 3）中央路程1.80±0.33 0.50±0.241）1.85±0.252） 3）

图1 应激与REMSD对大鼠海马区GDNF蛋白表达的影响

3 讨论

CUMS被广泛应用于抑郁症的动物模型，其有效性可持续几个月，具有较好的表面效度，符合抑郁模型的要求[5]。本研究应激组、REMSD组大鼠在CUMS 28 d后，自发活动开场实验中总路程和中央路程较正常对照组均减少，表明大鼠应激后自发活动减少，出现抑郁样行为。与抑郁症患者的兴趣下降、意志活动减退具有一定程度的相似性。本研究中CUMS在导致大鼠出现抑郁样行为的同时，能够降低海马区GDNF蛋白的表达，与Liu等[3]的研究一致。提示CUMS可能通过降低海马区GDNF的表达导致大鼠出现抑郁样行为，海马区GDNF表达降低可能是抑郁症的发生机制之一。已有文献[6-7]报道抑郁症病人外周GDNF的表达降低。最近有研究发现GDNF能够通过诱导抗氧化物和降低氧化应激水平，对中枢神经系统起到保护作用[8]，而抑郁症经常伴发神经炎症及氧化应激水平的增高[9]。因此，我们推测GDNF的表达降低有可能是减少对神经的保护作用而在抑郁症的发生机制中起重要作用。

本研究还发现，大鼠经过72 h REMSD后，其自发活动增加，提示REMSD可以改善大鼠的抑郁样行为。这与既往研究结果是一致的，睡眠剥夺能够快速改善抑郁症患者的抑郁情绪，其在24 h内即可发挥抗抑郁效应[10]，而服用抗抑郁药常需要2周甚至更长的时间才能起效。REMSD可以发挥快速抗抑郁作用，这为我们探索新的抑郁症治疗策略提供了一定方向。

本实验并未发现REMSD 72 h对抑郁模型大鼠海马区GDNF的表达有明显影响，结合行为学结果提示GDNF本身可能并未参与REMSD快速抗抑郁的机制。既往文献[11-12]报道在动物模型上应用抗抑郁药，同样对海马区GDNF的表达无明显影响。尸检研究也发现服用抗抑郁药对抑郁症病人的海马等多个脑区GDNF的表达无明显影响[13]。临床研究也发现服用抗抑郁药对血清GDNF水平无明显影响[14]。Chen等[11]研究发现电休克治疗对大鼠海马区GDNF mRNA的表达无明显影响，但增加了海马区GDNF受体GFRα1和GFRα2 mRNA的表达，这提示GDNF受体的高表达可能是电休克治疗抑郁症的机制之一。本研究未检测GDNF相关受体的表达变化，有可能其受体的表达变化在介导REMSD快速抗抑郁机制方面起重要作用。另外，抑郁症患者不同脑区GDNF表达水平也可能存在差异[2]，我们的研究仅检测了海马区GDNF的变化，未来的研究应该继续检测额叶、纹状体等脑区，通过对多脑区、多通路的研究来更好地探索睡眠剥夺快速抗抑郁的机制。

综上所述，CUMS可能通过降低海马区GDNF的表达导致大鼠出现抑郁样行为，REMSD可以快速改善大鼠的抑郁样行为，但GDNF本身可能并未参与其中快速抗抑郁的机制。