石 璇，李双涛，吴 杰，高分飞

（汕头大学医学院 1.药理学教研室，2.脑功能与疾病实验室，广东 汕头 515041）

获得特定脑区形态和活性良好的单个神经细胞，是研究特定脑区神经元生理功能和药理特性的基本条件。虽然目前已经能够成功培养存活2周以上的原代神经元细胞，但原代培养还只限于取材胚胎或新生幼仔的脑组织，这与成年神经元细胞在生理功能和药理特性上还是有一定不同；而且酶解分离培养需要大量的组织细胞，只取材特定脑区的组织，如海马CA1区，获得的细胞数太少；加上无菌条件下取材特定脑区组织的操作相对烦琐，使得原代培养还无法完全取代急性分离方法。本研究探索建立一种小鼠特定脑区神经元的急性振动分离方法，通过膜片钳记录技术对其进行电生理特性检测，评估分离效果。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器

C57BL/6J小鼠，12～18 d，雌雄不限，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。

HEPES、Tris、两性霉素B、葡糖酸钾、琼脂糖、谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）、甘氨酸均购自美国Sigma-Aldrich公司，链霉蛋白酶购自德国Calbiochem公司，其余所用无机盐均为市售分析纯试剂。CompresstomeTMVF-200振动切片机购自美国Precisionary Instruments公司。膜片钳系统组件包括：Axopatch 200B放大器、Digidata 1322A数字转换器（美国MDC公司），IX71倒置显微镜（日本Olympus公司），MC1000e显微操作器（美国SD公司），PP-830微电极拉制仪（日本Narishige公司）。HW-1000超级恒温水浴购自成都泰盟软件有限公司；WZ-II台式真空泵购自上海之信仪器有限公司；自制针式振动细胞分离器，示意图见图1，将拉制的玻璃微电极尖端以火抛光成直径0.1 mm左右的圆球形，固定于电磁继电器的衔铁上，通过方波刺激器控制振动频率；自制U形管给药系统。

图1 振动分离神经元装置示意图

1.2 溶液配制

分离液：蔗糖212.7 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，MgCl23 mmol/L，CaCl21 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，室温下通以95%（体积分数）O2和5%（体积分数）CO2混合气饱和，pH 7.4。人工脑脊液：NaCl 124 mmol/L，KCl 5 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，室温下通以95%（体积分数）O2和5%（体积分数）CO2饱和，pH 7.4。标准液：NaCl 150 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，用Tris滴定pH至7.4。膜片钳实验电极内液：葡糖酸钾150 mmol/L、MgCl28 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，用Tris滴定pH至7.2。20 mg两性霉素B溶于1 mL二甲基亚砜中配成母液，每10 μL分装于0.5 mL EP管中避光冷冻备用。

1.3 海马CA1区锥体细胞分离

小鼠经异氟烷吸入麻醉，迅速开胸，左心室快速推注冰冷的分离液约10 mL，灌流脑组织。断头，剪开头顶皮毛分两边，沿矢状缝和人字缝剪开颅骨，将2片颅骨掀开，取脑放入冰冷的分离液中约1 min。用琼脂糖包绕固定，在冰浴下用振动切片机沿冠状面切成400 μm厚的脑片，转移至持续通95%O2和5%CO2的人工脑脊液中，室温下孵育1 h。将脑片转移至加入链霉蛋白酶（1 mg/6 mL）的人工脑脊液中，根据鼠龄在31℃酶解20～40 min，酶解过程中持续通入95%O2和5%CO2。酶解结束将脑片转移至人工脑脊液中，稳定20 min左右。将脑片转移至盛有氧饱和标准液的35 mm培养皿中，以U型网状脑片固定小配件（美国Warner Instruments公司）压住脑片防止移动，在倒置显微镜低倍镜下找到海马CA1区，将玻璃针头置于其上，以方波刺激器控制振动频率为4～5 Hz，水平振动幅度大约1 mm，逐渐下压振动海马CA1区组织，使组织松散，神经元细胞脱逸出来。最后取出脑片，让分离出的神经元细胞静置10 min左右贴壁，即可用于膜片钳实验。

1.4 穿孔膜片钳记录

选择胞体较大、细胞轮廓清晰、轴突较粗和长的神经元置于倒置显微镜工作台中央，用标准液作为细胞外液灌流，贴壁牢固者为佳。玻璃微电极（G-1.5，日本Narishige公司）由拉制仪分两步拉制而成，电极电阻通常为5～6 MΩ；将电极尖端浸入电极内液中，利用毛细现象使电极尖端先吸入一些电极内液，再反向充灌含400 μg/mL两性霉素B的电极内液。调节微操纵器使电极尖端轻轻压上细胞后，施加少许负压，形成吉欧封接。等待两性霉素B慢慢打孔，形成穿孔全细胞模式。

2 结果

2.1 急性分离小鼠海马CA1区神经元的形态

相差显微镜下观察分离的海马神经元，状态和活性好的细胞一般保留基本形态特征，包括胞体、树突和轴突，胞体呈锥形或三角形，整个细胞胞膜清晰、胞体透亮、胞浆均匀一致，并保存有较长的轴突、树突，立体感较强，贴壁好（图2）。若细胞损伤较严重或死亡，则胞膜模糊，突起断裂或呈串珠状，胞浆有明显的黑色颗粒。

图2 急性分离C57BL/6J小鼠海马CA1区神经元

2.2 小鼠海马CA1区神经元电生理特性

分离的小鼠海马CA1区锥体细胞易于形成高阻封接，电极尖端接触细胞后给予很小负压即可形成高阻封接。活性良好的锥体细胞常有自发的动作电位发生，两性霉素B穿孔后，在电流钳制模式下即可观察到自发和诱发的动作电位（图3）。细胞的活性与细胞的静息膜电位相关，活性好的细胞静息电位均在-50 mV以上（由于未作串联电阻和漏电流补偿，与真实值有一定差异）；活性差的细胞静息电位值低，自发动作电位少，低于-40 mV即使给予电流刺激也诱发不出动作电位。

图3 电流钳模式下小鼠海马CA1区锥体细胞自发和诱发的动作电位

在电压钳模式下，钳制电位为-20 mV，以步阶为10 mV复极化到-50～-30 mV，脉冲宽度为1 s，可记录到复极化的电压依赖性钾电流M，见图4。

图4 小鼠海马CA1区锥体细胞的M电流

在电压钳模式下，钳制电位=-50 mV，U形管快速给药系统管口距细胞约100 μm，将含1 mmol/L谷氨酸的标准液，加于锥体细胞周围1 ms，然后迅速冲走，可记录到谷氨酸受体依赖性离子通道内向电流；若将含100 μmol/L NMDA和3 μmol/L甘氨酸的标准液，加于锥体细胞周围1 ms，可记录到NMDA受体依赖性离子通道内向电流（图5）。

图5 小鼠海马CA1区锥体细胞的谷氨酸和NMDA受体依赖性离子通道电流

3 讨论

脑组织神经元细胞的传统分离方法是脑组织切片后酶解，然后分离特定脑区的组织，用管口口径从粗到细的吸管逐级吹打，得到单个分离的细胞[1-2]。本文中所用分离方法的原理和传统分离方法相似，在脑组织酶解松散以后，用机械吹打或振动的形式，使细胞脱离下来。但吹打的分离方法常用于大鼠的脑组织，因为小鼠等小动物的某些核团或功能区太小，解剖镜下选取不易准确定位，分离时易连带其他脑区组织。而玻璃微电极尖端细小，振动幅度才1 mm左右，在40倍镜下选取脑区较精准。我们的实验结果显示，分离的神经元不仅形态特征保持较完整，而且不需要多聚赖氨酸涂层，分离的神经元也能稳定贴壁于清洁培养皿。并且分离的神经元还保持了良好的电生理活性。Akaike等[3]发现酶消化易破坏神经元细胞膜上的NMDA受体通道，而本法可记录到这类受体通道电流。当技术掌握纯熟的时候，对于幼龄的脑组织，还可以不经过酶消化，直接在脑片上振动分离得到细胞。这种纯机械分离的神经细胞胞体上还带有许多突触前膜[4]，可以检测反映细胞间突触联系的突触后电流。

理论上，脑片越薄越有利于氧和养分的渗入，使得神经细胞活性保持越长久。但一般认为，脑片切面100 μm内的细胞是受损的，故而刨除上下2个切面附近的受损细胞，脑片厚度至少要大于200 μm。对于脑片膜片钳实验，只要脑片内有少量的活性细胞就可以满足实验的需要，所以脑片厚度一般切250 μm即可；而对于分离单个神经细胞，在机械分离过程中又会损伤绝大多数细胞，脑片中必须有较大数量的活性细胞才能保证小概率下获得几个形态和活性良好的细胞，综合两方面因素，分离神经细胞的脑片厚度以400 μm为宜[5]。

小鼠海马CA1区脑组织对缺氧敏感，在孵育及酶处理过程中必须连续不断地供给氧气。通气时要注意防止脑片随气泡翻动。从我们的经验来看，小鼠海马CA1区腹侧脑组织比背侧更强壮，同样条件下，腹侧分离的好细胞要更多些。分离下来的神经细胞，活性随着时间延长下降较快，大概3 h后，活性普遍明显下降。故而实验过程中，首先要挑选细胞形态最好的培养皿中的最好的细胞进行实验，以免按分离顺序进行下来，每个细胞活性都不是最好，每个结果都不太理想。

综上所述，急性振动分离法分离的神经元不仅具有较好的电生理活性，而且可以较精准地分离特定脑区的神经元，是研究特定脑区单个神经元生理功能和药理特性的一种好方法。