欧阳春，韩 振，叶小强，黄 磊

（北京大学深圳医院心血管外科，广东深圳 518036）

冠状动脉性心脏病（coronary heart disease，CHD）是临床动脉粥样硬化中常见的心血管性疾病之一，主要为冠状动脉发生粥样硬化或血管痉挛导致血管腔狭窄或阻塞，导致心肌暂时性缺血缺氧或心肌梗死的心血管疾病[1]。据统计[2]，在我国15岁以上人群中，冠心病在城市、农村及城乡结合地区的患病率分别为1.2%，0.8%和1%，且因冠心病死亡患者所占比例在所有心血管疾病中约为37%。有研究表明[3-5]，大部分冠心病患者具有明显的家族遗传病史，发病具有家族聚集性的特点，其中三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP binding cassette subfamily A member 1，ABCA1）对机体胆固醇的转运和高密度脂蛋白的形成发挥重要作用，而编码该蛋白的基因与冠心病的发病具有密切关系。有研究发现[6-7]，脂肪酸结合蛋白3（fatty acid binding proteins 3，FABP3）作为一种主要存在于心肌细胞中的蛋白，在缺血、缺氧时可迅速释放入血，可作为心肌梗死的一种重要标志物。但目前，对ABCA1基因多态性联合FABP3对于预测多支血管病变的稳定期冠心病尚未见报道。本研究拟初步探讨ABCA1基因多态性联合FABP3对冠状动脉多支血管病变的预测价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年11月～2019年11月期间在我院心内科住院治疗的237例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者作为研究对象，根据患者冠状动脉造影结果，按照病变血管支数，将患者分为单支病变组（n=101）和多支病变组（n=136）。入选标准：①患者诊断符合中华医学会制定的《稳定性冠心病诊断与治疗指南》，且冠状动脉狭窄诊断的影像学检查明确，即存在主要冠状动脉、右冠状动脉及其粗大分支中至少有一支血管管腔的狭窄程度≥70%；②患者年龄≥18周岁，男女不限，自愿参与本研究并签订知情同意书；③患者住院期间临床资料准确完整。排除标准：①患者伴有严重的基础疾病如肝肾功能障碍性疾病、慢性心力衰竭或恶性肿瘤疾病等；②患者并发有精神性疾病病史。

1.2 试剂与仪器 本研究所涉及的主要试剂有DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；血清FABP3检测试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）；琼脂糖，三羟甲基氨基甲烷（美国Promega公司）；硼酸，纯净水（生工生物工程上海股份有限公司）；SAP缓冲液（上海联迈生物工程有限公司）。使用的主要仪器有微量分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司）；高压电泳仪（君意东方电泳设备有限公司）；电子分析天平（上海皓拂仪器仪表有限公司）；台式离心机（上海医用分析仪器厂）。

1.3 研究方法

1.3.1 ABCA1基因测序

1.3.1.1 ABCA1基因突变位点的选择：采用实时荧光定量PCR方法，对可能与冠心病相关的ABCA1基因4个常见突变位点进行检测，突变位点信息详见表1。

1.3.1.2 基因组DNA的提取：采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）对入组患者的血样进行DNA提取。

表1 ABCA1基因4个突变位点信息

1.3.1.3 DNA含量和纯度检测：使用北京凯奥科技发展有限公司生产的K5600超微量分光光度计分别检测260nm和280nm两处波长下DNA样品的吸光度值，对DNA含量检测。DNA样品浓度采用Lambert-Beer定律进行计算，采用A260mm/A280mm比值评价DNA样品纯度。

1.3.1.4 引物设计：见表2。采用Assay design3.1软件设计上述4个位点在聚合酶链反应所需的引物。

表2 4个突变位点的引物设计

1.3.2 Hard-Weinberg平衡检验：为考察研究样本是否具有良好的代表性，对两组患者ABCA1基因4个突变位点发生频率采用卡方检验判断是否符合Hard-Weinberg平衡，若P值大于0.05，则认为该研究群体处于Hard-Weinberg平衡状态。

1.3.3 FABP3等生化指标检测：采用双抗体夹心ELISA法，使用FABP3检测试剂盒（上海康朗生物科技有限公司，中国）检测血清FABP3水平。采用全自动生化分析仪（ADVIA2400，西门子医疗系统有限公司，德国）检测患者总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）及空腹血葡萄糖（fasting blood glucose，FPG）。

1.4 统计学分析 本研究中采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以频数和百分比表示，组间比较采用卡方检验。检验水准设定为0.05，即当P＜0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般临床资料比较 见表2。本研究共纳入237例冠状粥样硬化性心脏病患者，根据冠状动脉造影检查结果，单支病变患者101例（42.6%），多支病变患者136例（57.4%）。两组间在性别、年龄、体重指数（body mass index，BMI），TC，TG，HDL-C及LDL-C等指标上差异无统计学意义。多支病变组FABP3水平高于单支病变组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 单支病变组和多支病变组患者一般情况比较

2.2 Hard-Weinberg平衡检验 见表3。采用拟合优度χ2检验对单支病变组和多支病变组患者的ABCA1基因4个位点的基因型分布进行检验，结果显示，两组患者4个多态性位点的基因型频率分布符合Hard-Weinberg平衡（P＞0.05），因此，可以认为本次研究对象的群体代表性较好。

表3 Hard-Weinberg平衡检验

2.3 ABCA1基因突变频率比较分析 见表4。对两组患者ABCA1基因的4个位点进行检测，经χ2检验，单支病变组和多支病变组中仅rs363717突变位点基因型和等位基因频数差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 两组患者FABP3水平比较 采用t检验对两组患者FABP3水平进行比较，结果发现多支病变组患者FABP3水平（2 946.53±453.59pg/ml）高于单支病变组患者（2 249.50±603.21pg/ml），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 ABCA1基因4个位点的基因型和等位基因频数分布比较[n（%）]

2.5 Logistic回归分析结果 见表5。对患者ABCA1基因rs363717位点及FABP3水平进行Logistic回归分析。结果表明，高水平FABP3（OR=1.003，95%CI：1.002～1.003）是冠心病患者发生多支血管病变的主要危险因素，而ABCA1基因rs363717位点突变（OR=0.511，95%CI：0.296～0.884）则是冠心病患者发生多支血管病变的保护性因素，结果具有统计学差异（P＜0.05）。

表5 Logistic回归分析结果

2.6 FABP3及rs363717位点突变对冠状动脉多支血管病变的预测价值 见图1，表6。ROC曲线显示，FABP3曲线下面积（AUC）为0.518 (95% CI：0.439～0.596，P=0.642)，经计算最佳临界值为2 449.1 pg/ml，rs363717位点突变曲线下面积（AUC）为0.854(95% CI：0.805～0.903，P＜0.01)。

表6 FABP3及rs363717位点突变预测能力的曲线下面积

图1 FABP3及 rs363717位点突变预测能力的ROC分析曲线

3 讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病是一种累及整个冠状动脉系统的慢性心脏疾病，根据冠状动脉造影检查，临床中常可按照病变的累及范围和程度，将其分为单支病变和多支病变[8]。有研究表明[5,9-10]，多支血管病变的冠心病患者中，其冠状动脉血管壁的斑块负荷更加严重，疾病的治疗和预后与单支病变患者具有一定差异。因此，如何在治疗早期即对冠心病患者单支和多支病变进行预测和判断，对分析血管病变和冠状动脉血管缺血事件的关系，选择恰当的治疗手段，最大程度地改善患者预后具有重要意义。

FABP3主要存在于心肌组织，由132个氨基酸残基组成[11]。研究表明[6]，冠心病患者体内血清FABP3水平显著高于健康受试者，其原因是在心肌细胞发生缺血、缺氧等损伤时，FABP3可通过受损的细胞膜大量释放入血。本研究结果提示，单支血管病变的冠心病患者FABP3水平显著低于多支病变患者，这表明FABP3的血清水平可能反映了冠心病患者血管累及范围和程度。与周梦迪等[14]研究结果类似，该研究显示患者血清中FABP3水平随着冠状动脉病变范围和累及支数的增加而升高，因此认为FABP3血清水平与心肌梗死患者冠状动脉病变的严重程度和累及范围呈正相关。分析其机制可能与下列因素有关：①影响心肌细胞的能量代谢。FABP3可为细胞提供能量，参与到心肌脂肪酸的能量代谢过程中，当FABP3基因表达被抑制时心肌细胞内ATP合成显著减少[13]；②FABP3可减轻机体内的氧化应激反应。当心肌细胞由于长时间内缺血、缺氧可引起长链脂肪酸和乙酰辅酶A等产生氧自由基的物质聚集，加重心肌细胞氧化应激，而FABP3具有清除氧自由基的功能，可通过减少心肌细胞膜受脂质等衍生物的毒性作用达到减少氧化应激反应的作用[14]；③FABP3与细胞凋亡有关。有研究表明[12]，抑制FABP3基因表达可诱发心肌细胞凋亡。根据以上情况推断，当冠心病患者冠状动脉病变支数增加，血管狭窄程度更重时，心肌细胞缺血缺氧的数量不断增加，从而进一步加重氧化应激反应，影响能量代谢，导致FABP3释放入血，使其在血清中水平迅速升高。

ABCA1在体内主要参与体内HDL-C的形成以及胆固醇的逆向转运过程，对降低血液中胆固醇起到促进作用[15]。有研究表明[16]，ABCA1基因多态性与冠心病的发生具有一定关系。本研究发现，单支病变组rs363717位点野生型患者显著低于多支病变组，而杂合突变的患者则高于多支病变组，这提示rs363717多态性位点的A等位基因很可能是冠心病的致病因素。位于3’UTR非编码区的rs363717突变位点发生碱基突变后可导致ABCA1基因编码的蛋白质结构发生变化，从而影响mRNA的稳定性，并对mRN和miRNA的相互作用产生影响。有研究表明[17]，ABCA1基因rs363717位点突变降低冠心病的易感性可能是通过阻碍mRNA和miRNA互补结合并增加mRNA的稳定性而发挥作用。与我国学者杨博[18]的研究结果类似，该研究发现，当rs363717位点的等位基因A突变为G时，冠心病的发病风险降低，从而认为等位基因G是冠心病的保护因素。

综上所述，本研究结果发现单支病变组和多支病变组患者在FABP3水平和ABCA1基因rs363717基因位点突变上具有显著性差异。FABP3水平升高以及ABCA1基因rs363717基因位点为AA的患者是发生多支血管病变的独立危险因子，对预测冠状动脉多支血管病变具有一定临床价值，但由于样本量有限，还需要扩大样本量进一步研究证实。