金 鹿，娜美日嘎，孙海洲，桑 丹，李胜利，张春华，张崇志，任晓萍，珊 丹，凌树礼

（内蒙古自治区农牧业科学院动物营养与饲料研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

钙（Ca）是动物体内极为重要的一种常量矿物质元素，参与动物体骨骼和牙齿的构成，参与神经调节，维持血液、肌肉、细胞膜的正常功能，保持酶的活性。Ca2+稳恒是动物的各项生理活动（如肌肉的收缩、信号传递、骨质的沉积、细胞更新）正常进行的基础[1]。动物机体Ca 的代谢主要包括胃肠道吸收、骨动员和肾重吸收三大关键点，其中胃肠道吸收中的跨细胞膜吸收方式占70%左右，是维持Ca2+稳态最主要的因素[2]。据文献报道，Ca2+的跨细胞吸收依赖于一定数量和活性的胞膜钙转运蛋白的参与，瞬时性受体电位通道香草酸受体（Transient Receptor Potential Vanilla Receptor 6，TRPV6）、维生素D依赖性钙结合蛋白（Vitamin D-dependent 9 ku calcium-Binding Protein，CaBP-D9k）、维生素D 受体（Vitamin D Receptor，VDR）是该吸收途径中主要的限速大分子，也是主要的动力学参数[3-5]。由此可见，探索其在胃肠道的表达特征对深入研究Ca2+跨膜吸收动力学具有重要意义。现有对肠道中Ca2+代谢相关基因的研究多集中于人、小鼠、大鼠等单胃动物上，而有关反刍动物的研究报道极少[4,6]。近年来，随着科学技术的发展，实时荧光定量PCR 已成为定量检测基因表达水平强有力的工具。因此，本研究以内蒙古白绒山羊断奶羔羊为研究对象，旨在应用实时荧光定量PCR 技术定量检测CaBP-D9k、TRPV6和VDR在胃肠道中的mRNA 表达差异，为进一步阐明反刍动物胃肠道Ca2+吸收机制提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 RNAisoTMPlus（No：D9108A）、Prime ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa，No：DRR036A）、SYBR premix EX TaqTM（TaKaRa，No：DRR041A）、EASY Dilution（No：D9160）、DNA Marker DL2000（No：D510A）、6×Loading Buffer（No：D604）均购自TaKaRa 公司（大连）。氯仿（≥99.8%）、无水乙醇（≥99.7%）、异丙醇（≥99.7%）、琼脂糖皆由北京化学试剂公司生产，核酸染料由天根生化科技有限公司生产。

1.1.2 主要仪器 超低温冰箱（Thermo Forma）、凝胶成像分析系统（GENE 公司）、高速低温离心机（Eppendo rf5810）、荧光定量仪（ABIMP3005，USA）、PCR实时定量仪（Illumina Eco）。

1.1.3 试验动物及样品采集 试验选取9 只内蒙古白绒山羊4 月龄断奶羔羊，自由采食、自由饮水10 d 后进行屠宰，快速分离各段胃肠道组织，包括瓣胃、皱胃、瘤胃、网胃，以及十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠，从各段肠道中上部取3 cm 样品组织，通过预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）对其进行冲洗，迅速放入液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 提取RNA 根据RNAisoTMPlus 提取试剂盒的说明，提取胃肠道组织的总RNA。通过酶标仪检测提取物OD 值A260/A280在1.8～2.2，符合总RNA 提取的纯度要求。于2% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测，总RNA 提取质量良好，完整性高。

1.2.2 反转录cDNA 反转录操作过程应依据Prime Script RT reagent Kit 试剂盒说明书，在冰上操作。反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.2.3 相对荧光定量PCR 使用荧光定量PCR 仪（ABIMP 3005）应用SYBY Premix Ex TaqTM试剂盒进行定量分析。反应体系总体积为20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，PCR Forward/Reverse prime（r10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 2 μL，RNase Free H2O 7.2 μL。实时荧光定量PCR 程序：95.0℃预变性30 s；95.0℃ 30 s 变性，60℃30 s 退火，72.0℃ 20 s 延伸，并实施循环反应40 个；70℃时进行51 个0.06 s 的循环，再进行熔解曲线的绘制。

通过Primer 5 和Olige 6 软件对羊的各个基因的PCR特异性引物进行设计，具体参照表1 的引物序列。由上海生物工程技术服务有限公司对得到的引物进行合成。

1.4 统计分析 试验数据处理采用Excel 表格计算，试验中测定基因（CaBP-D9k、TRPV6和VDR）表达量的对数值（y）与Ct 值（x）呈反比例关系，且相关系数都趋于1（r2＞0.98），扩增效率都趋于1（E=0.8～1.2），可以利用2-△△Ct公式进行相对表达量的计算。利用 软件的进行单因素方差分析，选用Duncan's 进行多重比较。对试验结果进行判断时，差异显著水平设为P＜0.05。

表1 引物信息

2 结果

2.1 内蒙古白绒山羊胃肠道中TRPV6mRNA 表达量由图1 可知，TRPV6mRNA 表达量最高的部位在十二指肠，其次是空肠，然后是网胃，回肠、皱胃表达量较低，最低为结肠，四者差异显著。小肠肠段内空肠与回肠内TRPV6mRNA 表达量接近（P＞0.05），但均显著高于胃（瘤胃、瓣胃）和大肠（盲肠、结肠、直肠）。

2.2 内蒙古白绒山羊胃肠道中CaBP-D9kmRNA 的表达量 如图2 所示，CaBP-D9kmRNA 在十二指肠中表达量最高，远高于胃肠道的其他部位（P＜0.05），而在大肠内则处于较低水平。在消化道中，CaBP-D9k的表达量顺序为十二指肠＞空肠＞网胃＞结肠＞瘤胃＞瓣胃＞皱胃＞直肠＞盲肠＞回肠。由此可见，随着小肠肠道向后延伸，CaBP-D9kmRNA 表达量逐渐变低。

2.3 内蒙古白绒山羊胃肠道VDRmRNA 表达量 如图3 所示，VDRmRNA 在十二指肠内的表达量显著高于其他胃肠道，依次为十二指肠、空肠、结肠、直肠、盲肠、回肠、网胃、皱胃、瓣胃、瘤胃，即小肠＞大肠＞胃。

3 讨 论

Ca2+的跨细胞吸收途径主要为Ca2+经TRPV6 介导入胞、与CaBP-D9k结合并转运至细胞另一侧、由PMCA1b 和钠钙交换体运载出胞外排入血3 个步骤[7-8]。CaBP-D9k、TRPV6、VDR 作为影响Ca2+吸收动力学参数的主要限速大分子，在胃肠道各组织中的分布特异性较强，在Ca2+跨膜的吸收上分工不同，在调控中共同发挥作用[9]。本研究结果显示，内蒙古白绒山羊断奶羔羊各肠段中TRPV6、CaBP-D9k、VDR3 个基因的特异表达不同，使得消化道各部位对Ca2+的吸收存在不同特征。

本试验结果得出，TRPV6、CaBP-D9k、VDR在内蒙古白绒山羊胃内的表达水平均较低，表明胃并非是Ca2+吸收和调节中的主要位点，在Ca2+稳恒维持中发挥作用不大，这与前人的研究结果类似[10-11]。因此本试验将瘤胃作为分析对照样本。

小肠作为Ca2+吸收的主要部位，吸收量高达90%[12]。然而，小肠各部位对于Ca2+的吸收能力不同，十二指肠对Ca2+的吸收特点是速度快、量少，而回肠对Ca2+的吸收特点则是速度慢、量大。此外，小肠内食糜的停留时间对于小肠各段的Ca2+吸收量影响较大，经测定食糜在回肠中停留时间达到100～120 min，在十二指肠却极短，只有2～6 min[13]。而在小肠对Ca2+的吸收方式上，主要通过跨细胞膜和旁细胞2 种形式将Ca2+转运到血液中，进而维持血钙稳恒[14]。其中，Ca2+的跨细胞吸收主要依赖于胞膜钙转运蛋白的数量及活性，受食糜滞留时间影响较小，近端小肠是这一途径的主要位点，而旁细胞过程主要与胃肠道内外Ca2+电化学浓度差有关[15]。本研究发现，在小肠肠段，随着十二指肠向空肠、回肠的延伸，CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表达量均降低。据研究报道，在饲粮Ca水平不足的情况下，十二指肠对代偿性维持正常Ca 吸收起重要作用，常伴有较高的Ca2+跨膜吸收相关基因表达[16]。本研究中，在内蒙古白绒山羊断奶羔羊十二指肠中检测到了小肠肠段中最高的CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表达量，提示十二指肠是小肠内Ca2+经TRPV6 介导入胞，通过VDR 的调控，与CaBP-D9k特异相结合，是Ca2+跨膜吸收途径中效果最好的位点[4]。在Ca2+经旁细胞途径吸收中，主要受胃肠道内外Ca2+电化学浓度差影响，由于食糜在回肠停留时间最长，该部位是旁细胞途径吸收的主要位点。因此，Ca2+跨膜吸收相关基因表达量在该位点有所降低[17]。这与本研究结果相符，即在小肠肠道内，以回肠的CaBP-D9k、VDR、TRPV6mRNA 表达量最低。

此外，大肠在改善肠道功能、营养物质吸收方面的调节作用不容忽视。食物中的Ca 运行至小肠末端时，未吸收的部分进入大肠。近端大肠可吸收这些不易被利用吸收的外源Ca 或内源Ca，同时也可有效吸收远端小肠分泌的Ca。Karbach[18]报道在大鼠体内大肠前段Ca的吸收量最大，占大部分，达到十二指肠与结肠的10 倍。Wilson 等[19]研究发现，盲肠和结肠也能吸收少量的Ca，吸收量占整个肠道的7%。Karbach 等[20]通过45Ca的体外测定方法，发现钙含量在盲肠中累积最多，证实在大鼠体内，盲肠是Ca 吸收的主要部位。然而，也有报道指出，食糜流经整个胃肠道中，盲肠对Ca2+吸收量极其有限，从而使得Ca2+跨膜转运相关基因表达较低[16]。盲肠的Ca2+跨膜吸收作用极其关键，该部位对Ca2+吸收能力对于整个消化道Ca2+的吸收起决定性作用[4]。此外，Lutz 等[21]研究表明，大鼠内Ca2+的吸收主要集中在远端结肠与直肠部位，并非近端盲肠，这一研究结果也被Trinidad 等[22]所证实。本研究结果得出，3 个基因的mRNA 表达量在盲肠、结肠、直肠中差异不显著，但从数值上看，结肠中CaBP-D9k和VDR的mRNA 表达量高于盲肠与直肠。这与前人的研究结果不尽一致，这可能与试验所选取的动物种属不同等有关。然而，目前对大肠Ca2+吸收机制相关的研究报道较少，尤其在断奶羔羊领域的研究更少，有待于更进一步的研究探讨。

4 小 结

本研究结果表明，CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 均在十二指肠中表达量最高，CaBP-D9k和TRPV6mRNA 与VDRmRNA 分别在大肠内、胃内处于较低的表达水平；CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表达量随着小肠的延伸而逐渐降低；CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表达量受到胃肠道Ca2+跨膜吸收能力的影响，它们之间关联度较高。