张树山，张德福，戴建军，吴彩凤，孙玲伟

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106）

优秀种公羊是影响育种效率的核心因素之一，而精液冷冻保存技术正是提高优秀种公羊利用效率的重要途径。羊冷冻精液的应用不仅能通过减少公羊饲养数量来提高经济效益，也可大大降低或避免疫情发生的风险，在绵羊的新品种培育和遗传资源保护方面均具有重大意义[1]。绵羊精液冷冻保存技术始于20 世纪50 年代，最初冷冻精液（采用牛冷冻稀释液）人工授精受胎率仅为5%，80 年代的平均受胎率才达到50%左右[2]。从20世纪90 年代至今，绵羊冷冻精液的输精效果受冷冻技术水平、母羊发情鉴定及输精方法等多个环节因素影响，常规方法输精的受胎率不到60%，而采用腹腔镜子宫角输精能获得与鲜精相当的水平[1]。普遍认为，绵羊精液冷冻保存技术发展和应用相对滞后，主要受制于以下因素：第一，落后的硬件水平使羊精液冷冻保存技术长期处于低水平的平台期；第二，绵羊子宫颈的特殊的螺旋形构造，运动能力降低的冷冻精子通过子宫颈难度较大，导致绵羊冷冻精液授精受胎率远低于鲜精水平，且一直没能建立与冷冻精液相配套的非手术法深部位输精方法；第三，活体种公羊仍是国内绵羊育种企业遗传资源交流的主要形式，对绵羊冷冻精液需求不是很紧迫。此外，羊精液和体细胞等冷冻保存技术大多由相关科研单位攻关并掌握，而在过去几十年里，国内产、研资源整合程度较低，这也是制约国内绵羊育种和集约化生产进程的一个重要因素。

近十年来，家畜精液冷冻研究和标准化生产的硬件水平得到极大提高，如精子冷冻仪、降温平衡及精液灌装-封口等设备的广泛应用，使家畜冷冻精液实现商业化和标准化生产成为现实，为绵羊精液冷冻保存技术的提高提供了较好条件。各级政府部门已通过项目和政策支持等手段促进科研院所与畜牧企业联合申报、主持科研项目及科研成果转化，已取得显著成效。此外，近几年由于家畜活体运输导致疫情频发，导致活体种羊远距离引种难度增大，冷冻精液可能是最合适的替代形式。本文对绵羊精液冷冻技术研究发展现状做一综述，建议加强绵羊生产企业和科研单位资源整合，以期提高绵羊精液冷冻保存技术水平并推动冷冻精液的商业化生产。

1 绵羊精液冷冻保存技术的关键因素

1.1 冷冻稀释液

1.1.1 冷冻稀释基础液（含有鸡蛋卵黄但无甘油等冷冻保护剂）绵羊冷冻稀释基础液主要有以下几类：①基于柠檬酸-果糖（或葡萄糖）、脱脂牛奶、乳糖、蔗糖、Tris 的稀释液。绵羊精液的渗透压约为382 mOsm，早期研究者们考虑到稀释液加入甘油后会导致溶液渗透压下降，其认为高渗透压的“柠檬酸-果糖（或葡萄糖）卵黄稀释液”中的单糖可进入精子细胞内，从而降低渗透压变化对精子产生的负面影响[3]。利用柠檬酸-果糖（或葡萄糖）类稀释液制备羊冷冻精液的输精受胎率为17%～40%[4]。②基于脱脂牛奶的稀释液。早期试验发现，脱脂牛奶（巴氏消毒处理）单独使用或与柠檬酸、葡萄糖等组合使用，相互之间冷冻效果差异不大[6]。脱脂牛奶稀释液在欧洲国家应用较多，冷冻精液输精的受胎率平均在30%～45%[4]。该类稀释液的优点是简单、方便，尽管动物源成分的牛奶存在生物安全风险，目前仍广泛使用[5]。③基于乳糖的稀释液。乳糖能在冷冻降温过程中降低溶液结晶温度，与EDTA-Na 组合的稀释液的冷冻效果较好，该类稀释液广泛用在牛、猪和绵羊等家畜[7]精液冷冻。Platov 等[6]在绵羊上利用乳糖类冷冻稀释液结合两步稀释法制作颗粒冻精，受胎率约为26%～60%。④基于蔗糖的稀释液。早期研究就发现，蔗糖保护精子顶体完整性的功能优于葡萄糖和果糖等双糖[7]。故研究者们在蔗糖稀释液基础上添加维生素E、二丁羟基甲苯（Butylated Hydroxytoluene，BHT）和海胆色素A（Echinochrome A）等抗氧化剂，开发出多个配方并使用至今，制作的绵羊颗粒冻精受胎率为19%～55%[8]。⑤基于Tris 的稀释液。20 世纪70 年代Tris 就开始用于绵羊精液冷冻，绵羊精子对Tris 的耐受浓度为250～400 M。Tris 与葡萄糖组合的效果优于乳糖和果糖等其他双糖，制作的颗粒冻精输精受胎率为30%～57%[9]。Tris-葡萄糖配方仍是目前常用的冷冻稀释液[10]。目前冷冻稀释液研发已不再局限于上述分类，研究人员以精子适宜的渗透压和pH 范围作为约束条件，采用糖类（单糖、双糖及多糖）、抗氧化凋亡成分及一些两性离子缓冲液等相互组合优化，研发出与细管法冷冻和精子冷冻仪相配套的冷冻稀释基础液[11-12]。

自动物精液冷冻保存技术研究以来，卵黄一直是保护精子免受冷休克打击的主要成分，其机理可能是卵黄中的低密度脂蛋白、磷脂及胆固醇等成分能进入精子质膜和顶体外膜中，通过增强膜稳定性来发挥保护作用[13-14]。近十几年来，出于对畜牧业的生物安全性和商品化稀释液生产的标准化等因素考虑，研究者们一直努力利用非动物源、类卵黄功能性成分替代卵黄，如已开发出多个大豆卵磷脂的冷冻稀释液配方，且对精子的冷冻保护效果与卵黄相当或接近。

1.1.2 冷冻保护剂 冷冻保护剂中尤其甘油在精子冷冻保存技术发展历程上至关重要，其在精子冷冻上应用使精子冷冻保存成为可能。作为渗透性冷冻保护剂，甘油有较强的亲水性，可以在细胞脱水过程中，通过改变精子细胞外渗透压来降低精子细胞内含水量，从而减少细胞内生成冰晶对精子的危害，且能限制和干扰水分子晶格的排列来抑制细胞内外水形成冰晶，使水处于过冷状态降低形成结晶的温度[15-16]；甘油也容易渗透进入绵羊精子细胞内，使水分和一些盐类排出胞外，避免电解质浓度增加的不良影响[17]。目前在绵羊精子冷冻中，颗粒法冷冻甘油较适宜添加水平为3%～4%，而细管法冷冻为6%～9%[1]。考虑到甘油和DMSO 等渗透性冷冻保护剂均有不同程度的毒性，研究者们采用两步稀释法，试图通过降低甘油与精子的接触时间和添加时温度来降低对精子毒性作用，结果表明与一步稀释法差异不显著且操作繁琐，故目前广泛使用一步稀释法，即在精液采集后（约30℃）就加入含有甘油（终浓度6%～8%）的稀释液，经1～3 h 降温平衡至5℃、冷冻[11,18]。

冷冻保护剂的发展趋势是利用无毒、高效的冷冻保护成分部分或完全取代甘油。研究证实，一些双糖和植物性多糖类[5]作为非渗透性冷冻保护剂对精子有较好的保护作用，但仍不能完全代替甘油为代表的渗透性冷冻保护剂，目前仍是通过甘油与非渗透性冷冻保护剂结合使用来提高精子冷冻保护效果。

1.1.3 冷冻稀释液的抗菌成分 动物精液及使用的稀释液中均含有丰富的营养物质、适宜的pH 和渗透压，在没有抗生素或抗生素失活情况下，细菌数量会以几何级快速增加。含有微生物或病原体污染的液态（4～20℃）和冷冻保存精液（-196℃）可能引起母畜繁殖障碍或疾病[19]。目前，抑制家畜精液中微生物和细菌的主要手段仍是添加青、链霉素等常规及一些新型广谱抗生素。然而，抗生素会使病原菌产生耐药性，且对精子有不可忽视的毒性作用。如在澳大利亚和德国约90%的猪AI 中心仍使用单一抗生素，其中保存精液检测出庆大霉素耐药菌的AI 中心比例分别为66.7%（18/24）和26%（88/344）[20]。出于耐药性和抑菌效果考虑，人们开始将一些新型广谱抗生素低浓度结合使用（即“鸡尾酒”法）用于降低精液保存过程中的抗生素耐药性[21]。此外，抗菌肽具有微量抗菌谱广（包括革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌和寄生虫）、抗部分带包膜病毒的作用，且大多数抗菌肽对正常真核细胞无毒性或低毒性、几乎无耐药性，被认为是现有抗生素的最佳替代品。迄今为止，已有一些人工合成抗菌肽在家畜精液保存中的研究[22-23]。然而，目前从已知海量的抗菌肽中筛选、试验工作量巨大，以及天然提取、化学合成和基因工程等方法仍存在局限性，故为精液冷冻保存寻找有效的抗菌肽来替代抗生素仍任重道远。

1.2 绵羊精子冷冻及解冻方法 在精子程序冷冻仪广泛应用前，绵羊精子冷冻普遍采用颗粒法或PVC 细管法，冷冻过程中的降温速率主要通过控制铜网或冷冻架与干冰或液氮面的距离实现。颗粒法冻精制作简单、成本低，但不易标记、易污染，且解冻不方便。而PVC 细管法不存在上述问题，且宜贮存、适合自动化的商业化冻精生产。近十年来，家畜精液冷冻的硬件水平得到了极大提高。通过调控降温速率的低温操作柜结合水浴方法，能使精液冷冻前降温平衡比传统的在冰箱内包裹降温更为平稳；精液细管自动灌装、封口和打印设备的广泛应用可大大节约劳动力且实现生产标准化；采用精子冷冻专用的程序化冷冻仪可以通过计算机控制液氮喷速精确控制精液降温速率，使精液冷冻降温程序实现最优化成为可能。综上，绵羊冷冻精液的商业化生产的硬件条件已具备。

冷冻精液的解冻要经过-15～ -60℃的危险温区，故精液的升温过程与冷冻过程对冷冻精子的品质同样重要。普遍认为，小剂型冻精采用高温快速解冻法效果好，而大剂型冻精则不适合快速解冻。Graham 等[24]研究证实，65℃快速解冻精液的产羔率显著高于40℃解冻。笔者所在课题组在湖羊上证实，冷冻精液细管（0.25 mL）在70℃条件下的解冻效果优于其他温度（待发表）。研究已证实，绵羊冷冻精液湿解冻法优于干解冻法[2]。解冻液中的抗氧化等成分可抑制解冻后精子活性氧（ROS）对精子的损伤，通过稀释降低渗透性冷冻保护剂的浓度可降低对精子的毒性作用，且能在保证有效精子数量前提下增加输精母羊的数量[25]。

1.3 人工授精及同期发情 由于绵羊子宫颈的生理结构特性，使得母羊因素-人工输精环节与精子冷冻效果一样重要。

绵羊属于季节性多次发情家畜，具有发情期短、发情症状不明显等特征，发情鉴定一般采用公羊试情，其准确性主要取决于输精员的经验。最近几年，研究发现绵羊的卵泡直径超过5 mm 以上时，利用B 超很容易鉴别并形成良好声像图，可以根据绵羊卵泡发育情况来预测排卵时间，能为操作人员提供输精较适宜时机[26]。但利用B 超进行发情鉴定存在设备成本高、对操作人员要求高等问题，在羊场普遍应用存在一定难度。

绵羊输精方法主要有阴道输精法（Vaginal artificial insemination，VAI）、子宫颈输精法（Cervical Artificial Insemination，CAI）、经子宫颈输精法（Post-cervical Insemination，PCAI）和腹腔镜输精法（Laparoscopic Artificial Insemination，LAI）4 种，技术要点及效果见表1。

Eppleston 等[27]研究发现，输精深度每增加1 cm，受胎率增加7%～12%，即输精部位越接近受精部位，输精效果越好。一些研究者通过改进常规输精器或输精前注射松弛子宫颈激素等手段增加绵羊输精深度，但冷冻精液的受胎率提高幅度不大[28]。早期冷冻精液输精试验多采用传统子宫颈输精法，该输精方法操作虽然便捷，但输精量大、情期需多次输精（2～3 次）和受胎率较低。目前在绵羊上常规手术法或腹腔深部位（子宫角）输精是适合冷冻精液输精的有效方法。手术法和腹腔镜可以清晰观察到绵羊卵泡和排卵点，是目前最直观、最准确的发情鉴定方法，能将少量冷冻精液越过子宫颈送至离受精部位更近的一侧或双侧子宫角，理论上能达到近100%的受胎率。其中，腹腔镜深部位输精法虽然对设备和操作有较高要求，但与手术法相比具有微创、出血少和术后母羊恢复快等优点。早在20 世纪80 年代，腹腔镜输精法在澳大利亚等养羊业发达国家就已广泛用于绵羊冷冻精液的输精。国内，腹腔镜技术最早应用于绵羊胚胎移植中，直到90 年代才开始有用于深部位输精的报道。张坚中等[29]、石国庆等[30]和王军建等[31]先后利用腹腔镜技术进行绵羊冷冻精液输精试验，情期受胎率在65.2%～75.8%。目前，国内一些专业化公司已建立了同期发情-腹腔镜输精技术体系并实现了商业化，能为国内绵羊冷冻精液的应用提供较完善的服务。

表1 绵羊的常用输精技术[25]

一般认为，在绵羊发情的适宜时间范围内输入的有效精子数比输精次数更为重要，但适宜的输精时机较难把握，故绵羊鲜精或冷冻精液的常规方法输精，通常采用多次输精来提高受胎率。以冷冻精液为例，一般在发情早期进行第1 次输精，间隔8～24 h 再进行第2 次输精，受胎率可提高12.5%～25.9%[25-26]；也有报道在情期内进行3 次输精，但能否提高受胎率存在争议。可见，采用常规输精法对冷冻精液的输精量有较高要求，而手术或腹腔镜输精法可以大大减少输精量，且只需要输精1 次即可。

同期发情技术能通过激素控制并调整绵羊群体的发情周期，使它们在特定的时间内集中表现发情，已在集约化、规模化的绵羊育种和生产企业中广泛应用，尤其与腹腔镜输精法结合并发展成为一个较成熟的技术体系，能大大提高鲜精或冷冻精液的受胎率[32]。目前，在绵羊上还没有较成熟、高效的非手术法深部位输精方法，在今后相当长时间内绵羊冷冻精液最有效、可行的输精方法仍然是结合同期发情的腹腔镜输精法。

2 通过产研结合促进绵羊精液冷冻保存技术发展及应用

2.1 国内科研单位与绵羊育种企业建立优秀种公羊“精子库”的迫切性和必要性 我国地方绵羊品种在世界绵羊遗传资源中具有重要的地位，但目前地方绵羊品种原有的优良特性逐渐退化，部分品种甚至已濒临绝种或绝种。其原因包括几个方面：第一，国内绵羊育种长期受肉用性能为主的市场导向影响，大量引入、饲养外来肉用品种对地方品种进行杂交改良，造成我国固有绵羊品种遗传多样性和纯种数量受到破坏和下降；第二，人们对地方品种的保护意识不足，用于地方绵羊品种保存的经费极为有限，而传统的活体保种需要建立专门化的保种场，基础建设成本较高；第三，我国部分绵羊育种、生产企业及保种场大多科技力量较弱，且与相关科研院所衔接不够紧密，在利用新技术进行遗传资源保存方面也存在较大困难。近三十年来，由于国外肉用和肉毛兼用的绵羊育种水平的比较优势，促使国内大型绵羊育种和生产单位耗费巨资从欧美养羊业发达国家大规模、持续引进优秀种羊，如德国肉用美利奴、特克塞尔、无角道赛特、波德代羊、夏洛莱、萨福克和杜泊羊等众多肉用品种，为改良我国已有肉羊品种发挥了积极的作用。故国内引进的大量优秀种羊以及自主培育品种/品系也是不可忽视的一个遗传资源宝库。

家畜遗传资源保存除活体保存外，主要有精子、卵母细胞、胚胎及体细胞冷冻保存等形式。其中，精液冷冻保存技术是公认的性价比最高的遗传资源保存方法。一方面，公畜的遗传影响、选择强度、选择准确性和年更新率等均远大于母畜，且跨场比较条件下群体变异度扩大，使得保存优秀种公畜的遗传资源更为有意义；另一方面，“精液冷冻保存-人工授精”的技术难度和成本均远低于“卵母细胞/胚胎冷冻-体外受精/移植”及“体细胞冷冻保存-克隆”等技术体系。以冷冻精液的形式来保存动物遗传资源始于20 世纪70 年代。在英国和德国等发达国家，早在七八十年代就已建立了牛、绵羊等冷冻“精子库”；前苏联也分别冷冻保存了26个品种牛和33 个品种羊的数十万份精液[33]。国内的家畜冷冻“精子库”建设相对滞后，保种仍以传统的活体保种为主。如“九五计划”中，我国建立了鲁西黄牛的精子和胚胎库，标志着精子冷冻保存技术开始用于我国家畜遗传资源保护[34]。然而，国内早期的家畜“精子库”建设是基于泡沫盒熏蒸、颗粒法冷冻等传统方法，冷冻精子品质和效率都较低；而当前家畜精液冷冻技术平台已今非昔比，部分畜牧科研单位和育种企业已拥有精子冷冻仪、精液的灌装-封口-标记等先进设备，为提高绵羊“精子库”的建设水平和效率达到新高度提供了有力保障。地方绵羊品种种质资源保护中，可以由科研单位或育种型企业发挥技术和设备优势，为传统保种场提供精子冷冻保存技术服务和“精子库”的维护；而企业的种质资源保存则通过与科研单位及专门化技术公司等社会资源的高效整合，能有效避免重复建设并实现社会资源的高效整合。

基于绵羊精子耐冻性存在明显的个体差异问题，先对种公羊群体进行精子耐冻性筛选，将耐冻性较好的种公羊精子入库长期保存，而对精子耐冻性较差公羊则通过体细胞的采集、培养后作冷冻保存，在需要时再用克隆技术将其“复活”。

2.2 国内绵羊育种企业以冷冻精液取代活体种公羊输出的必要性 种公羊的活体引种一直是过去和目前国内外引种的主要方式，高昂的引种成本（包括购买和运输费用）及种公羊饲养及管理成本是造成养羊业利润微薄的一个重要因素。此外，对引种单位及所在地域而言，引入遗传资源意味着面对潜在的生物安全危机。近几年，政府已加强了对家畜活体引种的规范和限制，先后出台了限制畜禽调运、加强畜禽移动监管等措施（《中华人民共和国农业农村部公告第2 号》，2018 年）。2013—2016 年，国内多地区频繁发生严重的小反刍兽疫疫情，2018 年非洲猪瘟疫情爆发，一次又一次地为全社会敲响了生物安全警钟。家畜活体长途运输门槛提高会大大增加家畜引种的难度和成本，预示着家畜活体引种被严格限制和取代已是大势所趋。普遍认为，低温（5℃）和冷冻保存精液是目前能取代种公羊活体引种的可行方式。现有技术条件下，猪液态保存精液在适宜温度（5℃）下的有效保存期普遍在2～6 d，辐射地域则取决于运输条件。但其使用受时空限制明显，仅适合近距离、短期内使用。

近几年来，在各级政府的宏观调控和业内人士的不懈努力下，国内家畜精液冷冻保存的硬件水平得到质的提升。继牛之后猪冷冻精液也开始步入商业化生产进程，广东温氏集团、上海祥欣畜禽有限公司等国内育种企业与科研院所或家畜精液冷冻专门化技术公司合作，并相继建立冷冻精液商业化生产平台，已开始为国内外客户提供优质遗传资源和配套技术指导。上海农业科学院畜牧所与上海永辉羊业有限公司等单位联合申报市科委“羊的精液冷冻保存技术研究”，便是产、研结合较好的范例。与牛和猪冷冻精液相比，绵羊冷冻精液实现商业化生产、销售还有一定差距。另外，建立绵羊冷冻精液相配套的深部位输精法，或使客户接受微创的腹腔镜输精方法，也是绵羊冷冻精液广泛应用的重要前提[35]。

养羊业完全可以参照猪冷冻精液的成功模式，绵羊育种企业与科研单位通过资源整合、共建冷冻精液商业化生产平台（或成立专门化公司），生产平台可建立在规模化绵羊育种企业中，或建立以小型仪器为主、可面向全国客户提供绵羊精液冷冻技术服务的流动平台；同时，在原活体种羊销售网络基础上建设绵羊冷冻精液销售、技术指导等体系，并加强网络销售、种羊遗传信息和售后服务等建设。

可以预见，以冷冻精液形式取代种公羊活体引种，不仅为引种公司安全生产提供有力保障，也能大幅度降低种公羊运输、饲养、管理及免疫等成本，从而提高绵羊育种和生产企业的经济效益。

3 小 结

普遍认为，绵羊冷冻精液的广泛应用将为其育种和生产模式等带来极大变化，是养羊业发展史上的一次技术革命。综上，推动国内大型绵羊育种企业独立或与相关科研单位及专门技术服务公司联合起来，推动绵羊精液冷冻保存技术发展并实现冷冻精液商业化生产，并同步实现我国地方品种和引进品种的优秀种公羊遗传资源有效保存，可加速国内绵羊联合育种进展，从而推动我国养羊业实现育种跨越式、可持续发展。