袁秀芝，唐 静，苏 琼

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院 药剂科，湖北 武汉 430077)

糖尿病是一类复杂代谢性疾病。我国是糖尿病大国，预计到2035年，中国的糖尿病患病人数将达到1.43亿[1-2]。糖尿病血管病变是糖尿病主要的并发症之一，也是导致糖尿病病人死亡的主要原因之一。黄芪是常用中药，研究表明黄芪总黄酮对改善糖尿病糖脂代谢有一定作用，本实验通过在高糖环境中培养HUVECs细胞，比较了三种不同浓度的黄芪提取物对高糖损伤的HUVECs细胞的保护机制，并检测ET-1、eNOS、p-eNOS水平以及mRNA和蛋白量的表达量，为黄芪的临床应用提供了进一步的证据支撑。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

HUVECs(武汉普诺赛生物科技有限公司)；黄芪总黄酮提取物(自提)；葡萄糖(GLu)购自南京建成生物工程研究所，Trizol试剂购自Aidlab公司，DL2000 DNA Marker购自TAKARA公司，P0013BRIPA裂解液购自碧天云生物技术公司，P0010BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧天云生物技术公司，兔多抗GAPDH购自杭州贤至生物有限公司(批号：AB-P-R 001)，兔多抗ET1购自武汉三鹰生物技术有限公司(批号：12191-1-AP)。

1.2 仪器

R-205型旋转蒸发仪(瑞士BuChi公司)；Multiskan MK3全自动酶标仪(Thermo scientific)；IX51型OLYMPUS倒置显微镜；EDC-810型PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)。

1.3 MTT检测黄芪提取物对HUVECs细胞活力的影响

将HUVECs细胞分为12组：①正常对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)；②高糖损伤组(葡萄糖浓度为30 mmo1/L)(以下简称高糖组)；③高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)(以下简称高渗组)；④黄芪总黄酮组高浓度(2 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称黄酮高)；⑤黄芪总黄酮组中浓度(1 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称黄酮中)；⑥黄芪总黄酮组低浓度(0.5 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称黄酮低)；⑦黄芪总多糖组高浓度(400 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称多糖高)；⑧黄芪总多糖组中浓度(200 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称多糖中)；⑨黄芪总多糖组低浓度(100 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称多糖低)；⑩黄芪总皂苷组高浓度(400 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称皂苷高)；黄芪总皂苷组中浓度(200 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称皂苷中)；黄芪总皂苷组低浓度(100 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下简称皂苷低)。各组均在高糖处理前2 h分别加入药物。取处于对数生长期，生长状态良好的HUVEC细胞，采用完全培养基调整细胞密度至3×104/mL，接入96孔板，每孔100 μL细胞悬液，同时设空白组，37 ℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS)；按实验分组处理每孔细胞，加入药物后分别于培养12 h、24 h、48 h后吸出培养基，加入150 μL DMSO震荡10 min；采用酶标仪测定各孔吸光值OD。

1.4 PCR检测黄芪提取物对高糖诱导培养的HUVECs中ET-1、eNOS的mRNA表达

采用Trizol法提取RNA后，逆转录成cDNA，设计相应的引物(表1)，采用实时荧光定量PCR检测，测定HUVECs细胞内ET-1的表达。以空白组数据2-ΔΔCt作为一个基准点，作为1，再将各组数据中各个点的数值和基准点比较，得到数据[3](见图4)。

表1 PCR引物序列

1.5 黄芪提取物对高糖诱导培养的HUVECs中总ET-1和p-eNOS蛋白表达的影响

倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，加入4 ℃预冷的PBS液洗涤细胞加入裂解液，充分裂解后，12 000 rpm离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，-20 ℃冻存备用。30%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，用1×TBS漂洗一次，加入含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h，分别加入一抗，4 ℃过夜，洗膜后分别加入HRP标记二抗，37 ℃摇床孵育2 h，用TBST充分洗涤PVDF膜；加入增强化学发光试剂(ECL)后置于曝光机上曝光，用BandScan分析胶片灰度值，以目的条带和GAPDH条带灰度值比值作为最终结果。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 MTT检测黄芪提取物对HUVECs细胞活力的影响

表2 黄芪提取物对HUVECs细胞活力的抑制率(%)

以实验各组与空白对照组OD的比值作为细胞活力抑制率，通过对HUVECs细胞活力抑制率的考察发现，高糖组会显著影响HUVECs细胞的活力，自给药后12 h起，黄芪提取物各组就能对高糖引起的HUVECs细胞损伤产生一定的保护作用(P<0.05))；随着培养时间的延长，黄芪提取物各组对高糖损伤的保护作用不断增强(P<0.05)，这说明不同浓度的黄芪提取物均能保护HUVECs细胞，并呈现出一定程度的浓度相关性，其中以高剂量黄芪提取物组对HUVECs细胞的保护作用最为明显(P<0.05)。

2.2 PCR检测黄芪提取物对高糖诱导培养的HUVECs中ET-1、eNOS的mRNA表达

图1 ET-1的mRNA的表达

图2 eNOS的mRNA表达

由图1可以看出，与正常相比，高糖组ET-1的表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，经过高、中、低浓度黄芪提取物干预后，ET-1的表达受到了一定程度的抑制；从上图还可以看出，黄芪提取物对HUVECs高糖损伤保护作用呈一定的浓度相关性，且高浓度黄芪提取物(黄酮高、多糖高、皂苷高)组能明显抑制ET-1的表达，说明高浓度黄芪提取物组对细胞的保护作用最强。

由图2可以看出，与正常组相比，高糖组eNOS的表达出现了明显下降，经过高、中、低浓度黄芪提取物干预后eNOS的表达量增加；高浓度提取物(黄酮高、多糖高、皂苷高)组与低浓度组相比，eNOS值增加最明显，这也说明高浓度组对细胞的保护作用最强。

2.3 Western blot法检测黄芪提取物对高糖诱导培养的HUVECs中总ET-1和p-eNOS蛋白表达的影响

图3 GAPDH蛋白表达

图4 ET-1蛋白表达

图5 eNOS蛋白表达

图6 p-eNOS蛋白表达

表2 ET1/GAPDH、eNOS/GAPDH与p-eNOS/GAPDH灰度值比值

由表2可知，各组间 ET-l蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比，高糖损伤组ET-1蛋白表达量出现明显升高(P<0.05)；而与高糖损伤组比较，三种黄芪提取物各浓度组均可抑制高糖所致的ET-1蛋白表达升高，且呈浓度相关性(P<0.05)，以高剂量提取物组作用最为明显(P<0.05)。

表2中，与正常组相比，高糖因素对eNOS蛋白的表达影响不明显(P>0.05)；黄芪提取物干预后，e-NOS蛋白表达也不显著(P>0.05)。结果提示，高糖、黄芪提取物对e-NOS蛋白表达基本无影响。

由表2可以看出，各组间 p-eNOS蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)，与正常对照组相比，高糖损伤组 p-e NOS蛋白表达较正常对照组明显下降(P<0.05)，通过三种不同浓度的黄芪提取物干预后，各组 p-eNOS蛋白的表达量明显增加，且在一定程度上呈现出浓度依赖的特点。这说明，黄芪提取物呈浓度依赖地促进高糖HUVECs中的e NOS磷酸化激活。

3 讨论

黄芪的降糖疗效比较确切，对其降糖机制的研究能更好地指导临床合理用药。本研究通过HUVEC细胞建立高糖损伤模型，采用黄芪中三种主要有效成分进行干预，从细胞学的角度，分析黄芪三种有效成分对HUVEC保护作用的机制。

近年来研究[6-7]表明，ET-1浓度与动脉粥样硬化和血管重构有关。ET-1是内皮细胞分泌的最有效的血管收缩因子，对血管具有强烈的收缩作用，ET-1分泌量增多会造成血管痉挛，引起血管平滑肌细胞增殖，导致血小板黏附、聚集，促进血栓形成[8]。本研究证实，高糖组基因表达HUVEC中ET-1基因的表达水平明显高于正常组，eNOS基因表达显著低于正常组，这说明高糖会增加心血管疾病事件的发生率；黄芪提取物的干预改善了高糖HUVEC中ET-1、eNOS基因的表达。

黄芪提取物改善高糖引起的血管内皮功能的机制较为复杂。p-eNOS作为血管中的一种保护蛋白，通过NO的产生减轻血流动力学压力，从而保护动脉壁免受损伤。本研究发现高糖可加重血管内皮的损伤，高糖会降低eNOS的活性，从而降低NO的生物利用度，所有这些过程都会对HUVEC产生影响，最终导致血管舒张功能下降和内皮功能障碍；黄芪提取物可显著增加p-eNOS的表达，保护了HUVEC，改善了血管内皮功能，降低了血管疾病的发生率。

NO由内皮NO合酶(eNOS)产生，其能自由地进入血管平滑肌细胞，是影响血管内皮功能的重要舒张因子。ET-1除了对传统的PI3K-Akt-eNOS、p38MAPK[9-11]通路产生影响外，还能激活RhoA，使NO介导的RhoA/Rock通路失活，且该通路会对血管和组织内皮的通透性产生重要影响。

综上所述，本研究从ET-1、eNOS、p-eNOS角度初步探明了黄芪提取物对高糖所致HUVECs的保护机制，但本研究的证据存在一定局限性，有待进一步从信号通路方面对其保护机制进行深入挖掘。