张育珍，何家垣，蒋壮飞，马蓉蓉，张起辉**

(1．西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；2．重庆大学 化学化工学院，重庆 400044)

白头翁[Pulsatillachinensis(Bge.)Regel]是一种传统的常用中草药，为毛茛科白头翁属植物，因其在清热、凉血、排毒、抗肠道阿米巴痢疾以及细菌感染中的显著作用而被广泛使用[1-4]。近期研究表明，白头翁中代表性成分白头翁皂苷B4(AB4)具有良好的生物活性，包括抗氧化、抗癌等[5-7]。但是目前AB4分离和预富集的方法主要集中在柱色谱和制备液相上，这些纯化方法需要昂贵的仪器或消耗大量有机溶剂以达到检测和富集目的，会使目标产物回收率下降，并且花费大量时间在样品前处理上，导致AB4标准品价格昂贵[8-9]。简单、快速的从复杂天然产物中分离得到其有效成分，一直是人们面临的难题。

分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)是一种在空间结构上对特定分子具有识别性能的聚合物[10]，具有稳定性好、选择识别性高等特点[11]，已经在很多领域包括固相萃取[12-14]、人造传感器[15-17]、药物分析[18-21]等有广阔的应用前景。磁性表面分子印迹聚合物(MMIPs)具有壳-核结构，结合位点位于印记表面，因此模板分子吸附和解吸速率快，而且结合磁性响应，只需磁控分离聚合物而不需要离心、过滤等冗杂操作[13]。多巴胺(DA)是一种含有邻苯二酚和氨基官能团小分子化合物，在弱碱环境中，其通过自聚合形成具有黏附能力的化合物聚多巴胺(PDA)[22]。Chen等[23]以DA为功能单体合成了印迹材料并用于蛋白质的预富集，Zhou等[24]利用DA自聚合形成PDA包裹在四氧化三铁(Fe3O4)上，用于模板蛋白的识别。因此，期望基于DA为功能单体和交联剂合成一种绿色、低成本的印记材料。然而，有些天然产物价格非常昂贵，这阻碍了印迹材料的发展。目前，以伪模板合成的印迹材料成功解决了模板不易洗脱、模板渗漏以及AB4作为模板分子昂贵的问题[25]。

作者采用表面分子印迹的方法，以磁性纳米材料Fe3O4作为支撑材料，鼠李糖(Rha)作为模板，DA·HCl作为功能单体和交联剂，制备出能识别糖苷配基的磁性分子印迹聚合物(Rha-MMIPs)。随后对Rha-MMIPs进行表征，并结合高效液相(HPLC)用于中药白头翁中AB4定向预富集研究。

1 实验部分

1.1 原料试剂与仪器

白头翁药材：购买于北京同仁堂，经重庆大学张起辉副教授鉴定为白头翁药材。

AB4：纯度≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司；盐酸·多巴胺(DA·HCl)、鼠李糖(Rha)：纯度≥98%，阿达玛斯试剂有限公司；甲醇、乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，市售。

扫描电子显微镜(SEM)：merlin compact，德国蔡司公司；透射电子显微镜(TEM)：JEM 2100F，日本JEOL公司；傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)：IR-Affinity-1，日本岛津公司；热重分析仪：TGA/DSL1/1600LF，瑞士梅特勒-托利多公司；高效液相色谱仪(HPLC)：安捷伦1260，美国安捷伦公司。

1.2 磁性分子印迹材料(Rha-MMIPs)制备

首先通过水热法制备Fe3O4纳米粒子(Fe3O4NPs)[26-27]，步骤如下。向乙二醇中加入1.35 g六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)；随后加入3.1 g无水醋酸钠(NaAc)和0.4 g柠檬酸钠(Na3C6H5O7)，200 ℃下反应8 h。反应结束后，反复洗涤产物Fe3O4NPs直至中性，真空干燥8 h。随后将75 mg Fe3O4分散于30 mL三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl，pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，超声混匀，然后向溶液中加入75 mg模板分子Rha，在摇床上震荡0.5 h。随后将75 mg功能单体DA·HCl缓慢加入上述溶液中于30 ℃暗室反应12 h。反应结束后，磁控收集聚合物，用V(乙腈)∶V(乙酸)=9∶1混合溶液洗脱模板分子，随后用无水乙醇和去离子水反复洗涤Rha-MMIPs直至中性，45 ℃真空干燥6 h。磁性分子印迹材料Rha-MMIPs合成步骤见图1。

图1 Rha-MMIPs合成及实际应用示意图

在不添加模板分子的情况下，重复以上实验步骤制备非印迹聚合物Rha-MMIPs，作为对照。

1.3 吸附实验

1.3.1 吸附热力学实验

将AB4标准品(结构式见图2)溶于Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，配置一系列AB4标准溶液(10、20、40、60、80、100 μg/mL)，分别将15 mg的Rha-MMIPs/Rha-MNIPs添加到AB4标准溶液中，随后将混合物放置在90 r/min、30 ℃摇床上反应。4 h后，磁控分离得到上清液。用HPLC测定峰面积，对照AB4标准曲线，计算Rha-MMIPs和Rha-MNIPs吸附后溶剂的浓度。平衡时吸附量Q按照公式(1)计算。

图2 AB4结构式

Q=(ρ0-ρe)×Vm

(1)

式中：Q为Rha-MMIPs或Rha-MNIPs对目标化合物的吸附量，mg/g；ρ0为AB4初始质量浓度，μg/mL；ρe为平衡时上清液中AB4质量浓度，μg/mL；V为吸附体积，mL；m为聚合物的质量，mg。

1.3.2 吸附动力学实验

将15 mg印记聚合物Rha-MMIPs/Rha-MNIPs加入ρ(AB4)=80 μg/mL溶液中，在90 r/min、30 ℃摇床上分别反应5、10、20、30、40、60、90、120 min。不同时间段在磁场作用下分离，得到上清液。随后用微孔滤膜过滤并利用HPLC定量分析，并计算上清液中ρ(AB4)。Rha-MMIPs或Rha-MNIPs的吸附量由式(1)计算。

1.4 Rha-MMIPs重现性实验

重现性是影响印迹聚合物应用非常重要的因素。在相同的条件下，合成6批印迹材料，每批聚合物取15 mg，加入ρ(AB4)=80 μg/mL溶液中，在摇床上，以90 r/min的转速、30 ℃反应60 min，随后利用磁场进行分离，取上清液过滤，并用HPLC定量计算上清液中ρ(AB4)。按照公式(1)计算6批Rha-MMIPs对AB4的吸附性能，从而评价Rha-MMIPs的重现性。

1.5 磁性分子印迹材料的实际应用

1.5.1 白头翁提取

每次加入200 mLφ(乙醇)=70%溶液于20 g白头翁粉末中分别提取3次，合并滤液，随后用等体积石油醚萃取3次，浓缩下层溶液得浸膏。随后浸膏用甲醇溶解待用。接着用活化好的D101大孔树脂分离，收集φ(乙醇)=50%洗脱液，浓缩得浸膏并用甲醇溶解，得到ρ(甲醇)=50 mg/mL溶液。

1.5.2 磁性分子印迹材料的实际应用

取上述甲醇溶液3 mL并用N2吹干，加入3 mL Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液复溶。之后向溶液中加入15 mg Rha-MMIPs，将混合物在振荡器上以90 r/min的转速、30 ℃反应60 min，用HPLC检测吸附前以及洗脱液中ρ(AB4)。

1.6 色谱条件

色谱柱为TC C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，0～6 min 30%～35% B，6～8 min 35%～100% B，8～12 min 100%～100% B，12～15 min 100%～30% B，流速1 mL/min；检测波长201 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 Rha-MMIPs的SEM和TEM

Fe3O4NPs、Rha-MMIPs的SEM和TEM见图3。

a Fe3O4 NPs的SEM图

由图3a可知，Fe3O4NPs呈球形颗粒、分散性较好、粒径均一，可以作为基质材料。由图3b可知，印迹层包裹在基质材料上，表面相对粗糙、分散性好、大小均匀。由图3c和图3d可知，Rha-MMIPs壳-核结构明显，其中Fe3O4NPs直径约200 nm，其外面包裹的印迹层约40 nm，表明已经成功制备出壳-核结构的印记聚合物。

2.2 Rha-MMIPs的结构特性

2.2.1 红外光谱表征

采用红外光谱表征Rha-MMIPs键合情况，结果见图4。

σ/cm-1

2.2.2 热重表征

采用热重分析仪表征聚合物的热稳定性，Rha-MMIPs热重分析见图5。

t/℃

由图5可知，当温度达到130 ℃，Rha-MMIPs质量减少3.04%，主要由于印记材料中水分的蒸发。当温度升高至340 ℃，其质量一直在减少，质量损失达到14.27%，这可能由于Rha-MMIPs表面印迹层以及有机成分的分解。结果表明Rha-MMIPs在130 ℃以内具有较好的热稳定性。

2.2.3 样品磁性分析

Rha-MMIPs的磁性分离效果图见图6。

a Rha-MMIPs在溶液中分散图

由图6a可知，Rha-MMIPs在Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，分散性较好，沉淀速度缓慢；在外加磁场作用下，Rha-MMIPs能快速(30 s)聚集到瓶壁，与溶液分开(见图6b)。这表明Rha-MMIPs具有一定的磁性，并且能达到磁性分离的效果，可以用于复杂样品中磁控分离。

2.3 Rha-MMIPs的吸附性能分析

2.3.1 Rha-MMIPs的等温吸附特性

Rha-MMIPs和Rha-MNIPs的等温吸附曲线见图7a。由图7a可知，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs吸附量随着初始质量浓度的增加而增加。ρ(Rha-MMIPs)=80 μg/mL时，吸附能力达到5.80 mg/g，明显大于Rha-MNIPs最大吸附量。这主要由于Rha-MMIPs表面吸附位点提高了其对AB4的吸附能力。而Rha-MNIPs的吸附能力是由聚多巴胺引起的。

利用Langmuir和Freundlich等温吸附模型对静态吸附数据进行拟合。

Langmuir等温吸附模型见式(2)。

ρeQ=1QmaxKL+ρeQmax

(2)

Freundlich等温吸附模型见式(3)。

logQ=mlogρe+logKF

(3)

式中：Qmax为饱和吸附量，mg/g；KL为Langmuir等温方程的平衡常数，mL/mg；拟合结果见图7b。KF为Freundlich等温吸附模型的平衡常数，mg/g；m为Freundlich等温吸附模型的非均质性指数。

ρ/(μg·mL-1)a 等温吸附曲线

平衡常数和相关系数见表1。

由表1可知，Langmuir等温吸附模型更适合Rha-MMIPs对AB4的吸附性能，其R2(0.998 2)高于Freundlich等温吸附模型，表明Rha-MMIPs与AB4属于单层吸附结合，可能源于材料表面空穴是均匀的。

表1 Langmuir等温吸附模型和Freundlich等温吸附模型参数

2.3.2 Rha-MMIPs的动力学特性

对Rha-MMIPs和Rha-MNIPs进行吸附动力学分析，结果见图8。

t/mina 吸附动力学曲线

由图8a可知，随着吸附时间增加，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs对AB4的吸附量也随之增加，当吸附时间为60 min，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs均达到吸附平衡。此外，Rha-MMIPs对AB4的吸附量远高于Rha-MNIPs，这说明Rha-MMIPs对AB4具有更大的亲和力。

为了进一步研究Rha-MMIPs对AB4的吸附动力学，对吸附数据进行准一级动力学和准二级动力学模拟，相关参数见表2。准二级动力学拟合曲线见图8b。由表2可知，准二级动力学具有较高的相关系数，更符合Rha-MMIPs对AB4的吸附。这也进一步表明，化学吸附是Rha-MMIPs吸附过程中的决速步骤。

准一级动力学方程见式(4)。

ln/(Qe-Qt)=lnQe-K1t

(4)

准二级动力学方程见式(5)。

tQt=1K2Q2e+tQe=1v0+tQe

(5)

式中：Qe和Qt分别为在平衡和时间t(min)时吸附剂的吸附容量，mg/g；v0为初始吸附速率， mg/(g·min)；K1为准一级方程的平衡速率常数， min-1；K2为准二级方程的平衡速率常数，g/(mg·min)。

表2 Rha-MMIPs模拟的两种动力学参数

2.4 Rha-MMIPs的重现性

不同批次Rha-MMIPs的吸附量见图9。

批次

由图9可知，相同条件下不同批次Rha-MMIPs对AB4的吸附量基本相同，表明Rha-MMIPs具有良好的稳定性和可重复使用性，Rha-MMIPs可以作为固相萃取剂广泛应用。

2.5 Rha-MMIPs的应用

白头翁中的AB4经Rha-MMIPs吸附前以及Rha-MMIPs洗脱液液相色谱图见图10。通过AB4标准溶液的色谱图可知在保留时间约为8.0 min为AB4色谱峰。比较吸附前以及洗脱液色谱峰发现，AB4色谱峰变化很大，表明AB4已被Rha-MMIPs吸附，而白头翁中其他物质峰面积基本保持不变，这可能因为AB4糖链末端为Rha以及印记空穴大小和氢键作用。因此实验制得的Rha-MMIPs可从白头翁粗提物中预富集AB4，可广泛用于AB4的固相萃取。

t/mina AB4标准品

3 结 论

采用表面分子印迹方法，以低成本、绿色化学理念，制备出能识别糖苷类化合物的Rha-MMIPs，该聚合物具有较好的磁性和热稳定性，其对AB4具有较强的吸附亲和力，能快速识别并磁控分离白头翁中的AB4。此外，Rha-MMIPs具有良好的重现性。为研究糖苷类化合物提供了新的固相萃取剂，对于降低AB4标品价格、加快AB4的检测速度以及提高检测的灵敏度具有非常重要的意义。