张银霞 ，沈文娟 ，韩雪琴，张振海，田 蕾 ，杨淑琴 ，罗成科，李培富(.宁夏大学 农学院，银川 7500； .宁夏回族自治区原种场，银川 75000；

3.宁夏农林科学院 农作物研究所，宁夏永宁 750105)

水稻(Oryzasativa)是重要的粮食作物，而被称为“水稻癌症”的稻瘟病会使水稻大幅度减产甚至绝收，是全球粮食安全的重大隐患。据全国农作物重大病虫害预警，2018年稻瘟病在中国的发病面积为7500万亩次，较2017年偏重流行[1]。在宁夏地区稻瘟病是常发性病害，也是重要的病害之一，严重威胁着水稻的产量和品质。对水稻新品种的培育来说，抗病基因的利用是抗病育种的基础和核心。抗性基因可操作性强、效果明显，因此，人们在很早以前就开始开展主要抗性基因的鉴定及其应用研究。Piz和Pik是水稻中目前报道含有广谱高抗稻瘟病最多的2个位点，它们分别包含Pi2、Pi9、Pizt和Pi1、Pikh、Pikm复等位基因[2-4]。Pita和Pib在中国很多稻区也表现出很高水平的抗性[5-6]，但这些位点或基因在国内品种资源中的分布及利用还缺乏完善的研究，限制了它们在育种中的应用。针对宁夏地区近几年选育的水稻新品种对稻瘟病抗性较低或仅能达到中抗，而全国各地都已实施新品种审定稻瘟病“一票否决制”，所以本研究拟采用已克隆抗稻瘟病基因的功能标记对宁夏水稻种质资源进行分子扫描，结合稻瘟病抗性的人工接种鉴定和自然诱发鉴定，进而开展稻瘟病抗性与抗性基因的关联分析，确定宁夏水稻抗稻瘟病的主要基因，揭示宁夏水稻抗稻瘟病的遗传基础。在此基础上，对主要抗病基因在宁夏水稻品种中的应用进行评价，以期为抗病品种的应用及抗病基因的分子标记辅助选择育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试水稻材料 以143份宁夏水稻种质资源(98份宁夏自育水稻品种和45份杂交后代)作为试验材料。

1.1.2 供试稻瘟病菌菌株 供试稻瘟病菌菌株由宁夏大学农学院植保实验室李文强老师提供，是从宁夏各水稻种植区收集到的致病性强且致病力频率高的稻瘟病菌经过单胞分离纯化后的菌株，如表1所示。

1.2 试验方法

1.2.1 宁夏水稻种质资源稻瘟病抗性的鉴定水稻材料在宁夏大学水稻育种基地种植，每个材料种植2行，每行10株，株距10 cm，行距26 cm，每隔2行种植1行诱发行(杨和白皮稻)。在水稻分蘖期采用人工接种和自然诱发相结合的方法进行稻瘟病抗性鉴定。在分蘖初期和盛期调查3次叶瘟，在抽穗期及黄熟期调查2次穗瘟。叶瘟的调查在每个小区以发病最重的2～3株的平均发病等级作为该品种的抗性级别，穗瘟的调查在每个小区随机抽查10株，记录发病率和病级。稻瘟病发病情况按照国际水稻所(IRRI)稻瘟病抗性评价叶瘟分级标准。抗性评价值越大，越容易感病。具体分级见水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程中的水稻稻瘟病抗性综合评价分级标准[7](高抗<0.1，抗0.1～2.0，中抗4.1～6.0，感6.1～7.5，高感7.5～9.0)。

表1 供试稻瘟病菌菌株Table 1 Rice blast strains in this study

1.2.2 宁夏水稻种质资源抗稻瘟病基因的分子扫描 引物合成：PCR特异性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司合成，序列见表2。

表2 稻瘟病抗性基因引物序列Table 2 Gene primer sequence of rice blast resistance

宁夏水稻种质资源基因组DNA的提取及扩增：采用改良SDS法提取水稻基因组DNA，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度[8]。然后以DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为20 μL，包含PCR缓冲液10×Buffer(25 mmol/L、含Mg2+)2.0 μL， dNTP(2.5 mol/mL)0.4 μL，引物( 4 pmol/L) 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U /μL) 0.2 μL，模板DNA(约15 ng /L)2.0 μL，最后用ddH2O补足20 μL。

PCR扩增反应程序：94 ℃，5 min；35个循环；94 ℃，45 s，退火温度依据引物说明而定， 72 ℃，1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，核酸染料染色，在紫外凝胶成像仪上观察并照相。

2 结果与分析

2.1 宁夏水稻种质资源稻瘟病抗性的鉴定

依照国际水稻所稻瘟病发病级别的标准对宁夏水稻种质资源进行抗性鉴定。结果发现宁夏水稻种质资源对本地区的稻瘟病以中抗和中感的材料居多。少数材料表现为感病和抗病。其鉴定结果如表3所示。

表3 宁夏水稻种质资源稻瘟病抗性鉴定结果Table 3 Performance of rice blast resistance of rice germplasm resources in Ningxia

(续表3 Continued table 3)

2.2 宁夏水稻种质资源抗稻瘟病基因的分子 检测

利用已克隆的抗稻瘟病基因Pita、Pikh、Pib、Pi2、Pikm、Pi9、Pi5、Pid2的功能标记对宁夏水稻种质资源进行分子扫描，结果发现在宁夏水稻种质资源中均检测到了抗稻瘟病基因，其数量从1个到6个不等。其中最多的有6个基因，分布在‘宁粳25号’‘宁粳28号’‘宁粳36号’‘花119’等。最少的是1个基因，分布在‘宁粳42号’‘大琥板稻’(表4)。基因数量相同的不同种质的抗性存在差异，说明稻瘟病抗性基因之间存在互作关系。部分PCR分子检测结果如图1和表4所示。

M.100 bp Ladder;1.宁粳3号；2.宁粳7号；3.宁粳9号；4.宁粳12号；5.宁粳14号；6.宁粳15号；7.宁粳16号；8.宁粳18号；9.宁粳19号；10.宁粳23号；11.宁粳24号；12.宁粳25号；13.宁粳26号；14.宁粳27号；15.宁粳28号；16.宁粳31号；17.宁粳32号；18.宁粳33号；19.宁粳34号；20.宁粳35号；21.宁粳36号；22.宁粳37号；23.宁粳38号；24.宁粳39号

2.3 宁夏水稻种质资源主要抗稻瘟病基因的分析

通过对抗稻瘟病基因在宁夏水稻种质资源中的抗性分布分析，发现含有Pid2基因的供试材料有90.91%的抗性达到中抗且没有发现感病材料，显著的高于其他基因组合的供试材料。含有Pita、Pikm、Pi9、Pi5、Pi2基因的供试材料分别有1.19%、0.91%、1.69%、1.35%、1.54%的抗性能够达到抗稻瘟病，其中含有Pikm基因的材料中没有发现感病材料，中感的比例也比较低，含有Pi9、Pi5、Pi2基因的供试材料没有发现感病材料(图2)。所以在抗稻瘟病分子标记辅助选择育种中Pikm、Pi9、Pi5、Pi2和Pid2是首选基因，可以作为宁夏水稻抗病性育种的优势基因。而含有Pita和Pib基因的材料发现感病材料，中感的材料比例也比较高，所以在抗病性品种选育中不可取。

2.4 主要抗稻瘟病基因在宁夏水稻种质资源中的分析

由图3可以看出，在宁夏水稻育种中表现优势的抗稻瘟病基因Pikm、Pi9、Pi5、和Pid2在宁夏水稻种质资源中的分布频率分别是0.56、 0.35、0.30和0.11，占的比例相对比较低。可见，在抗稻瘟病育种中应注意充分利用抗稻瘟病基因尤其是Pikm、Pid2和Pi9位点的相关基因。

表4 抗稻瘟病基因的分子检测结果Table 4 Molecular marker-assisted detection of blast resistance genes

(续表4 Continued table 4)

(续表4 Continued table 4)

(续表4 Continued table 4)

图2 抗稻瘟病基因在供试材料中的抗性分布Fig.2 Distribution of resistance gene to rice blast in tested materials

3 讨 论

目前水稻抗稻瘟病分子育种尽管取得了显著的成效，但是不同抗稻瘟病基因对田间哪些稻瘟病致病性菌株起作用难以预测，导致育种家在选育过程中难以选出相应的抗性基因[9]。如果明确了某一特定区域内多个抗稻瘟病基因的抗性和水稻品种中含有的抗稻瘟病基因类型，那么开展水稻抗稻瘟病新品种选育和品种抗性布局工作就有基础和理论指导。在水稻稻瘟病抗性基因评价方面，已陆续报道的抗性基因有84个[10]。李进斌等[11]分析了22个抗瘟基因在云南省3个稻区的抗性，确定了Pi9和Piz5的高抗地位；刘文德等[12]分析了24个抗瘟基因在福建省的抗性，Pikh抗性最强，抗谱达98.15%，Pi-1和Pi-9抗谱也较高，是优质抗源。宁夏水稻种质资源经抗稻瘟病基因的功能标记分子检测发现携带抗稻瘟病基因数可以达到6个[13]，但起主要作用的抗瘟基因尚不清楚。通过本研究发现在宁夏这个特殊气候和地理环境条件下，Pikm、Pi9、Pi5、和Pid2抗稻瘟病基因发挥着主要的作用，尤其Pikm抗性基因在供试材料中占了56%，能达到中抗的材料80.91%，充分说明了此基因的主要作用。何琳等[14]、薛清芝等[15]利用SSR分子标记分别对抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-15(t)进行检测，明确了部分水稻品种携带此基因的情况；时克等[16]利用Pi-ta和Pi-b抗稻瘟病基因序列内的功能标记对58份水稻品种进行了检测，明确了其在当地的分布情况。本研究在确定了宁夏地区主要抗稻瘟病基因的基础上，对其在宁夏水稻种质资源中的分布做了评价，发现发挥主要作用的抗性基因分布频率比较低，尤其Pid2抗稻瘟病基因仅占11%。但此抗性基因的抗性可达到90.91%。因此，为了加速抗稻瘟病基因的分子标记辅助选择育种，发掘和鉴定广谱持久抗稻瘟病基因，将其安全渗入或聚合到综合性状优良的水稻材料中是重要的基础。

图3 抗稻瘟病基因在宁夏水稻种质资源中的频率分布Fig.3 Frequency distribution of rice blast resistance genes in Ningxia rice germelasm resources