杨延红,姜倩倩,马俊艳,宋桂全,牟建莉

(潍坊学院 生物与农业工程学院,山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，山东潍坊 261061)

小白菜(BrassicachinensisL.)为十字花科芸薹属2a生草本，是中国广泛种植的重要叶用蔬菜作物，具有生长周期短、适应性强、易管理等特点，也是国内北方地区冬季的主要绿叶蔬菜[1]。小白菜属于杂种优势较明显的异花授粉作物，利用常规育种方法得到纯合亲本的周期长，难度大。目前，使用游离小孢子及花药培养的单倍体育种技术是缩短育种年限、提高育种效率的有效途径。而能否从小孢子培养和花药培养过程中获得单倍体植株，取材的小孢子发育时期非常关键。许多研究发现，多数植物在游离小孢子培养中，处在单核靠边期的小孢子更易诱导形成小孢子胚[2-4]。而小孢子发育时期与花蕾、花药的外部形态密切相关[5-8]。为提高单倍体植株的诱导率，需选择适宜的小孢子发育时期进行培养，但在培养过程中通过镜检确定每一个花药中小孢子的发育时期，十分费时费力，增加污染几率，影响小孢子活力；并且目前尚未有对小白菜小孢子发生和雄配子体发育的相关报道。为此，本研究通过观察小白菜小孢子不同发育时期的花器官外部形态，根据花蕾大小及花药颜色等判断小孢子发育时期，为适宜小孢子培养材料的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为不结球白菜 (BrassicachinensisL.)，又名小白菜，品种名上海青，花粉采集于潍坊学院设施蔬菜大棚，常规管理。在每天8:00左右采摘植株第二侧枝同一部位的不同大小花蕾，一部分花蕾用卡诺固定液固定，供后期制片观察，另一部分用于测量、观察花器官的外部形态指标。

1.2 方 法

1.2.1 花蕾外部形态特征观察 选取大小不同的小白菜花蕾(如图1)，采用数显游标卡尺测量小白菜的外部形态指标：花蕾纵横径、花萼和花瓣长，观察花蕾的外部形态特征；之后将花药剥离出来，测量花药的长度和宽度，观察花药的形态特征。计算出瓣萼比、花药长宽比和花蕾纵横径之比。对于每一个发育时期的花蕾观察和测量其外部特征数据15个，重复3次。

1.2.2 小孢子各发育时期观察 参考张恩慧等[8]的方法进行花蕾固定，采用压碎法制片，即先用镊子小心剥去花萼和花瓣，再用解剖针将花药取出挤压，用DAPI荧光染液染色、压片，最后制成临时装片，静置染色5～10 min，置于Olympus显微镜下观察拍照，确定小孢子不同发育时期。

1.3 数据处理

采用Excel 2013对以上指标进行分析。

2 结果与分析

2.1 小白菜小孢子发生及雄配子体发育过程

对不同大小花蕾的花药进行染色制片，观察小孢子发生(小孢子母细胞时期、四分体时期)、雄配子体发育(单核早中期、单核靠边期、2-胞花粉时期以及3-胞花粉时期)。

2.1.1 小孢子母细胞时期 小白菜花粉囊内次生造孢细胞间黏性较大，成片分布，随后形成较分散的由胼胝质包裹着的小孢子母细胞，随着发育，小孢子母细胞由不规则形状(图2-A)逐渐变为圆形(图2-C)，并开始进行减数分裂1期，在荧光显微镜下发现小孢子母细胞有两个明亮的核(图2-B、2-D)，因此，小白菜减数分裂中胞质分裂属于同时型，即第1次分裂后不形成细胞壁，第2次分裂后形成细胞壁。

A、B.不规则小孢子母细胞，C、D.两个近圆形的小孢子母细胞

2.1.2 四分体时期 小孢子母细胞减数分裂1期后胞质不分离，经过短暂的分裂间期后，两个核进入减数分裂2期，最终胞质同时分离，形成由共同的胼胝质包被的四分体，各个小孢子之间也有胼胝质分割(图3)，在显微镜下可观察到4个明亮的细胞核及外面透明的胼胝质。小白菜四分体大多为四面体型(图3-D、3-E)少数为十字交叉型(图3-A、3-B、3-C)，还有一少部分呈现不规则的立体效果，介于二者之间(图3-F、3-G)。

2.1.3 单核早中期 随着小孢子的进一步发育，包裹在四分体外面的胼胝质被酶解，释放出4个小孢子。刚释放的小孢子细胞壁较薄，还未形成花粉壁(图4-A)，液泡不明显，DAPI染色可见细胞核居于细胞中央(图4-B)；随后小孢子体积逐渐增大，花粉壁同步加厚，体积增加1～2倍时，细胞核依然位于中央，以上阶段为单核早中期小孢子(图4-C、4-D)。

2.1.4 单核靠边期 随着小孢子体积增大，花粉内小液泡不断增多，并逐渐融合成大液泡，将细胞核挤压到细胞边缘位置，花粉外壁沉积物质更多，细胞壁变得很厚(图5-A、5-B)，同时单核靠边期花粉开始出现3条明显的萌发沟，花粉此时呈三裂瓣状(图5-C、5-D)。

2.1.5 2-细胞和3-细胞花粉期 小孢子细胞核分裂后，形成营养细胞核和生殖细胞核，两个细胞核差异明显，其中，营养细胞核体积较大，而生殖细胞体积较小并靠近细胞壁(图6-A、6-B)。最终形成1个大的营养细胞包裹着1个小的生殖细胞，即2-细胞花粉。

随后生殖核经过一次均等的有丝分裂，产生两个子核，发育成两个外形相同的精细胞，在荧光显微镜下两个精细胞核非常明亮，而营养细胞核亮度相对较低(图6-C、6-D)，此时小孢子发育为成熟花粉粒，因此，小白菜花粉为3-胞花粉。

A-C.四分体(十字交叉型)；D、E.四分体(四面体型)；F、G.四分体(介于四面体型和十字交叉型之间)

A、B.刚从四分体释放的单核早期小孢子；C、D.形成花粉壁的单核中期小孢子

A、B.单核靠边期小孢子；C、D.出现萌发沟的单核靠边期小孢子

A、B.2-胞花粉；C、D.3-胞花粉；a.生殖细胞；b、c.营养细胞核；d.两个精细胞

2.2 小白菜小孢子发育时期与花蕾形态特征相关性

小白菜小孢子发育时期与花蕾纵径、花蕾横径以及花萼长、花瓣长等特征密切相关。从表1可以看出，花蕾纵横径、花萼长、花瓣长均随着小孢子发育显著增长。小孢子花蕾纵径为 0.85～1.32 mm，横径为0.84～1.20 mm，为四分体时期；花蕾纵径为 1.64～2.22 mm，横径为1.31～1.68 mm，为单核早中期；花蕾纵径为2.68～ 3.80 mm，横径为1.91～2.19 mm，为单核靠边期；花蕾纵径为4.02～4.82 mm，横径为2.27～ 2.40 mm，为2-胞花粉时期；小孢子花蕾纵径为4.99～7.00 mm，横径为2.48～3.08 mm，为成熟3-胞花粉。

表2表明，在小孢子发育过程中，肉眼可观察到，随着花蕾膨大，在单核靠边期时萼片由浅绿色变为绿色；四分体时期萼片紧包裹花冠；单核早中期萼片稍展开，花瓣微露出；单核靠边期萼片顶端展开较大，花瓣长于萼片；2-胞花粉时期花蕾较大，花冠稍微展开；3-胞花粉时期花冠完全打开。

表1 小白菜小孢子各发育时期花蕾形态特征Table 1 Bud morphological characteristics of microspore development of Brassica chinensis L. at various stages

表2 小白菜小孢子各发育时期的花蕾外部形状特征Table 2 Bud external morphology characteristics of microspore development of Brassica chinensis L. at various stage

2.3 小白菜小孢子发育时期与花药形态特征相关性

表3表明，小白菜的花药长、宽、和小孢子发育时期密切相关，其中四分体时期花药纵径 0.59～0.90 mm，花药横径0.17～0.41 mm，花药颜色为浅绿色(图7-A)；单核早中期花药纵径 1.06～1.73 mm，花药横径0.41～0.60 mm，花药颜色为浅绿色(图7-B)；单核靠边期花药纵径 1.76～2.39 mm，花药横径0.64～0.82 mm，花药颜色为浅黄绿色(图7 -C)；2-胞花粉时期花药纵径2.35～2.61 mm，花药横径0.83～0.90 mm，花药颜色为浅黄色(图7-D)；3-胞花粉时期花药纵径2.63～2.66 mm，花药横径0.96～1.06 mm，花药颜色为浅黄色(图7-E)。

表3 小白菜小孢子不同发育时期花药大小特征Table 3 Anther size characteristics of microspore development of Brassica chinensis L. at various stage

A.四分体时期；B.单核早中期；C.单核靠边期；D.2-胞花粉；E.3-胞花粉

3 结论与讨论

3.1 小白菜小孢子各发育阶段细胞学特征

多数植物成熟花粉属于二胞花粉[9]，如甜瓜、辣椒等成熟花粉含有一个生殖细胞和一个营养细胞[10-11]，少数植物花粉成熟时含有一个营养细胞和两个精细胞，如白芷和青花菜[12-13]。本试验对不同发育时期小白菜小孢子进行DAPI荧光染色制片，详细观察小孢子各发育时期的细胞学形态特征，其中小孢子发生过程中，胞质分裂为同时型，四分体大多为四面体型(图3-C)，少数为十字交叉型(图3-E)，有极个别四分体处于两者之间(图3-G)。雄配子体发育过程中，观察到单核花粉早中期、靠边期、2-胞花粉时期，最终生殖细胞分裂形成3-胞花粉(图6-C、6-D)，这与十字花科其他蔬菜研究结果一致[13-14]。

观察小白菜小孢子发育过程中，在单核发育期之前的小白菜花蕾非常小，因此笔者将花蕾直接置于FAA固定液中进行固定，制片时采取固定材料和活体材料同时压片DAPI染色，结果表明都可较好染上细胞核，所以在实际操作中，可不用固定材料，直接将花药置于10%的蔗糖溶液中挤压出小孢子，压片染色。

3.2 小白菜小孢子发育过程与花器官相关性

目前，花药和小孢子培养技术已取得了较大进展，但是在具体的实践操作当中，特定植物小孢子培养体系的建立受多种因素的影响，其中适宜小孢子发育时期的选择是关键[15]。发育时期过早，很难产生胚状体；发育时期过晚，成熟花粉含有的激素水平不平衡，导致脱分化能力较差，也不能诱导成胚。所以确定小孢子发育时期相对应的花器官外部形态指标至关重要，可提高小孢子培养的效率和成功率。已有研究表明，十字花科植物如甘蓝[16]、花椰菜[17]、芥菜[18]、芜菁[19]的单核靠边期是进行小孢子培养的最佳时期。通过小白菜花蕾纵横径、花瓣长、花萼长等特征测量观察和花药形态的观察，发现单核靠边期的小孢子，外部花蕾饱满呈绿色，花萼包被着花冠，花药为浅黄绿色，花蕾纵径为2.68～3.80 mm，花蕾横径为 1.91～2.19 mm，纵横径比为1.40～1.74，花瓣长为2.70～3.22 mm，花萼长为2.15～2.71 mm，瓣萼比为1.19～2.26，花药纵径长为 1.76～2.39 mm，花药横径为0.64～0.82 mm，花药长宽比为2.75～2.91，此时大多数小孢子处于单核靠边期。同时笔者在试验中发现，处于单核靠边期的小孢子花粉处于圆形和三裂形之间，这和张恩慧等[8]在甘蓝小孢子中的发现一致，说明同一属植物花粉发育过程较接近。因此，在小白菜小孢子培养中，可综合花蕾、花药的形态、大小和颜色等外观指标来判断小孢子发育时期，无需镜检、准确取材培养，有利于提高小孢子培养效率。