宫艺其 杨礼 艾雪峰 颜冰倩 谭瑶 王会景 徐徐 付炜 王伟

诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell，iPSC)是体细胞经重编程后得到的具有自我更新及多向分化潜能的干细胞。2006年，Takahashi等[1]首次利用4种转录因子oct4、sox2、c-myc，klf4将小鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)，随后又将人皮肤成纤维细胞重编程为人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cell，hiPSC)[2]，从而避免了获取胚胎干细胞所面临的伦理问题，为体外研究各种疾病提供了理想的细胞来源。2013年，Lian等[3]利用小分子物质GSK-3抑制剂及Wnt抑制剂，首次在体外高效分化得到人诱导多能干细胞来源的心肌细胞(Human induced pluripotent stem cell derived cardiac myocytes，hiPSC-CM)。目前，hiPSC-CM被用于建立疾病模型、心肌药物筛选等[4-8]，还被用作细胞治疗促进心梗、心衰后的心功能恢复[9-11]。2018年，日本率先批准临床采用hiPSC-CM心肌片用于重症心衰治疗。然而，hiPSC-CM对于许多常见血管活性药物的反应仍不清楚。因此，本研究使用临床常用的经典血管活性药物麻黄碱及阿托品，利用单细胞膜片钳技术，观察这些药物对hiPSC-CM动作电位的影响，为临床提供相关证据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

hiPSC：取自上海儿童医学中心李彦欣教授课题组，为脐带血细胞来源hiPSC。脐带血捐献者签署了相关知情同意书。本研究经上海儿童医学中心伦理委员会审查批准。

主要仪器：倒置相差显微镜(德国Leica公司DMI300B)，细胞培养箱(美国Thermo公司3111)，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司TSC SP8)，微电极拉制仪(美国sutter公司P97)，膜片钳系统(美国Axon公司700B)。

主要试剂：基质胶(美国Corning公司354234)，E8培养基(加拿大Stemcell公司05990)，EDTA(美国Thermo公司)，Accutase消化酶(加拿大Stemcell公司7920)，Y-27632(加拿大Stemcell公司72304)，RPMI1640(美国Thermo公司11875093)，B27 minus insulin添加剂(美国Thermo公司A1895601)，B27添加剂(美国Thermo公司17504044)，ChIR99021(加拿大Stemcell公司72054)，IWP-2(加拿大Stemcell公司72124)，心肌细胞消化液(北京赛贝生物技术公司CA2011007、CA2011008)，肌钙蛋白ctnt抗体(美国Proteintech公司15513-1-AP)，肌球蛋白轻链mlc2v抗体(美国Proteintech公司10906-1-AP)，α-辅肌动蛋白α-actinin抗体(美国Sigma-Aldrich公司A7811)，tra-1-60抗体(德国Merck Millipore公司MAB4360)，oct4抗体(美国Epitomics公司2876-1)，sox2抗体(美国Epitomics公司2683-1)，nanog抗体(美国Epitomics公司3369-1)，HEPES(美国Sigma-Aldrich公司H3375-250G)，EGTA(上海麦克林公司E6257)，ATP镁盐(美国Sigma-Aldrich公司A9187-500MG)，盐酸麻黄碱注射液(成都倍特药业有限公司)，硫酸阿托品注射液(湖北兴华制药有限公司)。

1.2 方法

1.2.1hiPSC传代培养

在提前铺好基质胶的6孔板中使用E8培养基培养hiPSC，每24小时更换一次。待细胞达到70%～80%汇合后，使用5×10-4mol/L的EDTA在37 ℃下消化5 min，然后按1∶6～1∶9传代至新的铺好基质胶的6孔板中。

1.2.2hiPSC心肌分化

使用Accutase消化酶将hiPSC消化成单个细胞，按1×106个/孔接种于提前铺好基质胶的12孔板，待细胞完全融合，加入含12 μmol/L CHIR99021的RPMI1640/B27 minus insulin分化培养基。24 h后更换普通RPMI1640/B27 minus insulin培养基。48 h后，加入含5 μmol/L IWP-2的RPMI1640/B27 minus insulin分化培养基。48 h后更换普通RPMI1640/B27 minus insulin培养基。再过48 h更换RPMI1640/B27培养基，以后每48小时更换一次RPMI1640/B27培养基维持培养，直至第30天。

1.2.3hiPSC干性鉴定

按1×105个/孔的细胞密度，将hiPSC接种于预先铺好基质胶的24孔板玻璃爬片上。待细胞融合至40%～50%时，室温下4%多聚甲醛固定20 min，0.5%TritonX-100室温破膜30 min，10%山羊血清室温封闭30 min，添加tra-1-60抗体、sox2抗体、nanog抗体、oct4抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜。PBS清洗3遍后，添加相应荧光二抗(1∶1 000)室温避光孵育120 min。dapi(1∶1 000)室温核染10 min，激光共聚焦显微镜观察。

1.2.4hiPSC-CM鉴定

按1×105个/孔的细胞密度，将hiPSC-CM接种于预先铺好基质胶的24孔板玻璃爬片上，置于培养箱培养24 h。待细胞完全贴壁后取出，室温下4%多聚甲醛固定20 min，0.5%TritonX-100室温破膜30 min，10%山羊血清室温封闭30 min，添加ctnt抗体、α-actinin抗体、mlc2v抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜。PBS清洗3遍后，添加相应荧光二抗(1∶1 000)室温避光孵育120 min。dapi(1∶1 000)室温核染10 min，激光共聚焦显微镜观察。

1.2.5动作电位电极内液、电极外液配制

电极内液(mmol/L)：KCl 150，NaCl 5，CaCl22，EGTA 5，HEPES 10，MgATP 5(pH 7.2，KOH)；电极外液(mmol/L)：NaCl 140，KCl 5，CaCl21，MgCl21，Glucose 10，HEPES 10(pH 7.4，NaOH)。

1.2.6hiPSC-CM动作电位检测

在分化至第30天、含有4×104个hiPSC-CM的35 mm 孔径培养皿中加入1 mL Accutase消化酶消化5 min，随后通过“Y-tube”灌流装置用动作电位电极外液灌流5 min。选取单个、细胞膜完整的心肌细胞作为记录细胞。记录电极用硅酸盐毛细玻璃管由微电极拉制仪拉制而成，充入电极内液后入液阻抗3～5 MΩ。当电极尖端与细胞膜表面形成1 GΩ 以上的高阻封接后，吸破细胞膜，补偿细胞膜电容，串联电阻补偿40%～50%，使用电流钳gap free 模式记录心肌细胞自发产生的动作电位。随后，通过“Y-tube”灌流装置用含500 μmol/L麻黄碱、100 μmol/L阿托品的动作电位电极外液给药5 min，记录两种血管活性药物对心肌细胞动作电位的影响。用Clampfit 10和Origin 8软件进行数据分析。

1.2.7统计学方法

2 结果

2.1 hiPSC干性鉴定

iPSC在基质胶上呈集落、克隆样生长，免疫荧光染色显示细胞核内多能性标志物oct4，sox2，nanog及细胞表面多能性标志物tra-1-60，均呈强阳性表达，表明此iPSC细胞系多能性良好，可用于后续心肌分化(图1)。

2.2 hiPSC心肌分化

将多能性良好的hiPSC按前述方法诱导心肌分化，观察干细胞向心肌细胞转变过程中细胞的形态变化。干细胞从分化开始时的紧密圆形，逐渐变为松散椭圆形的心肌前体细胞(Cardiac progenitor cell，CPC)，随着分化进行，细胞逐渐转变为集聚成条索状的心肌细胞(Cardiomyocyte，CM)，并在第12天出现自发搏动，随着分化时间的延长，细胞逐渐趋近成熟(图2)。

2.3 hiPSC-CM鉴定

为了进一步证明诱导分化得到的细胞为心肌细胞，我们通过心肌细胞特异性标志物染色对其进行进一步鉴定。免疫荧光染色显示，ctnt、α-actinin和mlc2v均呈强阳性表达。证明经过30 d分化，大部分细胞为相对成熟的心室肌细胞，可用于后续血管活性药物对动作电位影响的实验(图3)。

2.4 麻黄碱、阿托品对hiPSC-CM动作电位的影响

通过灌流系统对hiPSC-CM灌流动作电位电极外液。膜片钳系统显示，心肌细胞呈自发节律性动作电位，可见明显2期平台期，表明得到的细胞为心室肌细胞(图4A、C，图5A、C)。

通过同样方法对hiPSC-CM灌流含500 μmol/L麻黄碱的动作电位电极外液。膜片钳系统显示，加药后心肌细胞自发节律性动作电位频率明显增加(P=0.023)。动作电位波形无明显改变，去极化幅度(APA)、最大去极化速率(dV/dtmax)和90%动作电位时程(APD90)相比加药前无明显变化(图4，表1)。

A～C：oct4、dapi、merge免疫荧光；D～F：sox2、dapi、merge免疫荧光；G～I：nanog、dapi、merge免疫荧光；J～L：tra-1-60、dapi、merge免疫荧光(比例尺=25 μm) A-C: Immunofluorescence of oct4, dapi and the merge; D-F: Immunofluorescence of sox2, dapi and the merge; G-I: Immunofluorescence of nanog, dapi and the merge; J-L: Immunofluorescence of tra-1-60, dapi and the merge (Scale bar=25 μm)图1 hiPSC细胞核多能性标志物oct4、sox2、nanog和细胞膜多能性标志物tra-1-60的表达Fig. 1 The expression of hiPSC nuclear pluripotency markers oct4, sox2, nanog and cell membrane pluripotency marker tra-1-60

A：hiPSC心肌分化模式图；B：分化第0天；C：分化第6天；D：分化第12天；E：分化第30 天(比例尺=100 μm；CPC指心肌前体细胞；CM指心肌细胞) A: Schematic diagram of cardiac differentiation process of hiPSC; B: Cardiac differentiation on Day 0; C: Cardiac differentiation on Day 6; D: Cardiac differentiation on Day 12; E: Cardiac differentiation on Day 30 (Scale bar=100 μm; CPC refers to cardiac progenitor cells; CM refers to cardiomyocytes)图2 人诱导多能干细胞心肌分化过程Fig. 2 The cardiac differentiation process of hiPSC

A～D：ctnt、α-actinin、dapi、merge免疫荧光染色；E～G：mlc2v、dapi、merge免疫荧光染色(比例尺=100 μm) A-D: Immunofluorescence of ctnt, α-actinin, dapi and the merge; E-G: Immunofluorescence of mlc2v, dapi and the merge (Scale bar=100 μm)图3 人诱导多能干细胞来源心肌细胞的鉴定Fig. 3 The identification of hiPSC-CM

同样方法对hiPSC-CM灌流含100 μmol/L阿托品的动作电位电极外液。膜片钳系统显示，加药后心肌细胞自发节律性动作电位频率明显增加(P=0.001)。动作电位波形无明显改变，去极化幅度(APA)、最大去极化速率(dV/dtmax)和90%动作电位时程(APD90)相比加药前无明显变化(图5，表2)。

A：对照组动作电位频率；B：500 μmol/L麻黄碱组动作电位频率；C：对照组单个动作电位波形；D：500 μmol/L麻黄碱组单个动作电位波形 A: The frequency of spontaneous action potential of the control group; B: The frequency of spontaneous action potential of the 500 μmol/L ephedrine group; C: Representative action potential trace of the control group; D: Representative action potential trace of the 500 μmol/L ephedrine group图4 麻黄碱对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响Fig. 4 Effects of ephedrine on action potential of hiPSC-CM

A：对照组动作电位频率；B：100 μmol/L阿托品组动作电位频率；C：对照组单个动作电位波形；D：100 μmol/L阿托品组单个动作电位波形。 A: The frequency of spontaneous action potential of the control group; B: The frequency of spontaneous action potential of the 100 μmol/L atropine group; C: Representative action potential trace of the control group; D: Representative action potential trace of the 100 μmol/L atropine group.图5 阿托品对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响Fig. 5 Effects of atropine on action potential of hiPSC-CM

表1 500 μmol/L麻黄碱对hiPSC-CM动作电位的影响Table 1 Effect of 500 μmol/L ephedrine on action potential of hiPSC-CM

表2 100 μmol/L 阿托品对hiPSC-CM动作电位的影响Table 2 Effect of 100 μmol/L atropine on action potential of hiPSC-CM

3 讨论

本研究结果表明：所使用的hiPSC表达多能性标志，干性良好，经小分子诱导分化后获得的hiPSC-CM高表达ctnt、mlc2v等心肌细胞特异性标志物，且具有自发节律性动作电位。麻黄碱、阿托品可明显增加hiPSC-CM动作电位频率，而对RMP、APA、dV/dtmax、APD90无明显影响。

用于实验的hiPSC-CM均为分化大于30 d的细胞，Burridge等[12]认为hiPSC-CM随着培养时间的延长，心室肌细胞比例会逐渐增加，在肌原纤维、肌节形成以及电生理等方面均会趋近成熟。本研究对分化30 d得到的hiPSC-CM进行了形态学及电生理的鉴定，发现所得到的细胞高表达心室肌特异性标志物mlc2v，且动作电位有明显的2期平台期，与文献报道一致。但是，RMP、APA等与以往文献略有差异[13]，分析后认为可能是以下原因：①所使用的iPSC细胞系不同；②记录时液面波动导致记录不稳定；③记录时间略长导致细胞活性略有下降。提示不同细胞系及实验时长可能会对实验结果造成影响。

麻黄碱、阿托品是临床常用的血管活性药物，通过激动心肌细胞肾上腺素能受体或抑制乙酰胆碱受体而发挥作用。在本实验中，我们观察到麻黄碱、阿托品使hiPSC-CM动作电位频率明显加快，但动作电位波形无明显变化，与Calvert等[14]及Gizurarson等[15]使用人或小鼠心肌细胞系观察到的实验结果相一致，提示hiPSC-CM具有良好的药物反应性，与在体心肌细胞相似。

综上所述，hiPSCs通过体外小分子分化，可获得大量心肌细胞，麻黄碱、阿托品能够明显加快hiPSC-CM自发动作电位频率，对动作电位波形无明显影响。本研究证明了hiPSC-CM具有良好的药物反应性，为hiPSC-CM的临床应用及相关药物治疗提供了证据。