王健 周栩

小耳畸形是常见的先天性体表畸形，严重影响患者身心健康，耳郭再造是目前最有效的治疗手段，其关键是耳郭软骨支架的制备。目前，常采用自体肋软骨制备耳郭支架。组织工程的发展为耳郭再造提供了新的途径。脂肪干细胞(Adipose tissue derived stromal/stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离提取的具有多向分化潜能的成体干细胞。研究发现，ADSCs具有成软骨分化并形成软骨样组织的能力[1-3]。与BMSCs 相比，ADSCs具有来源广、易获得、创伤小、纯化率高、体外增殖速度快等优点，是构建组织工程软骨的理想种子细胞。

现有证据表明，不同的脂肪收获方法可能影响脂肪组织中ADSCs的质量和再生潜力[4]。超声辅助吸脂(Ultrasound-assisted liposuction，UAL)已在临床广泛应用，其基本原理是将电能转化为振动，引起热效应、空泡效应和机械效应，从而导致脂肪碎裂[5-7]。但目前尚不清楚超声辅助吸脂所获取的hADSCs对构建组织工程软骨是否存在不利因素，因此本研究通过第三代超声辅助吸脂获取hADSCs，并与残耳软骨细胞共培养，观察其在体内构建组织工程软骨的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器

6周龄雌性裸鼠6只(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

PLA、油红O工作液、茜素红(Sigma，美国)；Ⅰ型胶原酶(Invitrogen，美国)；10%FBS(Gibco，美国)；完全成脂培养基A、完全成脂培养基B、完全软骨分化培养基、完全成骨分化培养基(Cyagen，美国)；组织糖胺多糖总含量阿利辛蓝比色法定量检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)。

培养箱(Thermo，美国)；生物力学分析仪(Instron 5967，美国)。

1.2 人耳软骨细胞的获取和培养

来源于小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨，均获患者知情同意。取术中废弃的残耳软骨组织，去除软骨膜及周围组织，将残耳软骨块剪成1 mm3碎块，加入0.15%胶原酶，37 ℃摇床消化10～12 h，200目滤网过滤，2 000 r/min离心8 min，去上清后加入完全培养基重悬，计数后以1×104cells/cm2的细胞浓度接种于培养皿中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每3天换液一次，待软骨细胞生长至75%～80%融合时传代[8-9]，收集第2代细胞备用。

1.3 ADSC的分离、培养

脂肪移植物采集自10名要求进行吸脂塑形的健康女性志愿者。实验通过北京协和医学院伦理委员会审批，所有志愿者术前均签署知情同意书。抽脂部位选取同一患者的双侧大腿，左侧大腿使用第三代超声辅助抽脂，右侧大腿使用常规负压抽脂。局部肿胀麻醉后，第三代超声辅助抽脂技术采用3.7 mm、3环探头在50%功率下连续模式乳化脂肪，当几乎感觉不到阻力时停止乳化。常规负压抽脂采用3.7 mm长吸脂管进行常规负压脂肪抽吸(-0.5 bar)。获取脂肪组织后，剥除肉眼可见的筋膜、小血管等脂肪周围组织，剪成1 mm3大小组织块，加入终浓度为 0.075%的Ⅰ型胶原酶，37 ℃摇床内消化40 min，加入含10%FBS的低糖 DMEM 培养基终止消化，200目滤网过滤，1 500 r/min离心5 min，去上清后加入完全培养基重悬，计数后以5×104cell/cm2的细胞浓度接种于培养皿内，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每3天换液一次，待细胞融合达85%后传代，收集第3代细胞备用。

1.4 hADSCs诱导分化及检测

1.4.1成脂分化诱导

37 ℃的6孔板中加入第3代hADSCs，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养，直到细胞达到100%融合。将原培养基替换为2 mL完全成脂培养基A培养3 d，然后替换为完全成脂培养基B培养 24 h。培养基A和B重复交替3个周期。用10%中性甲醛固定30 min，1 mL油红O工作液染色10 min，显微镜下观察细胞。

1.4.2成骨分化诱导

取第3代hADSCs，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养，直到细胞融合达 80%～90%，替换为2 mL完全成骨分化培养基，每3天更换1次培养基。3 周后用10%中性甲醛固定30 min，1 mL茜素红染色5 min，显微镜下观察细胞。

1.4.3成软骨分化诱导

取第3代hADSCs接种于离心管中，加入完全软骨分化培养基，平均每管细胞数为2×105个。每3天更换1次培养基。在诱导培养基中培养4周后，固定细胞，石蜡切片，阿尔新蓝50～60 ℃染色15 min，显微镜下观察细胞。

1.5 材料支架的制作

取无纺PGA，均匀嵌入预制的圆柱状(直径5 mm、厚度1 mm)模具内，滴加含0.5%PLA的二氯甲烷溶液约50 μL，待其自然干燥后，用75%乙醇浸泡8 h，PBS洗涤3次，含10%FBS低糖DMEM培养基预培养过夜，准备接种细胞。共制作支架36个。

1.6 细胞-支架复合物的体外培养及分组

实验分为3组，每组12个细胞-支架复合物。对照组1(MC)，接种单纯残耳软骨细胞，细胞浓度为 5.0×107cells/mL。对照组2(Co-culture 1)，接种第2代残耳软骨细胞+常规负压抽脂获取的第3代hADSCs(1∶1)共培养，细胞浓度为 5.0×107cells/mL；实验组(Co-culture 2)，接种第2代残耳软骨细胞+第三代超声辅助抽脂获取的第3代hADSCs(1∶1)共培养，细胞浓度为 5.0×107cells/mL。3组细胞-支架复合物均置于含10%FBS的DMEM培养液中培养，每周换液3次，体外培养4周后，每组取6个标本进行相关检测，剩余6个植入裸鼠体内。

1.7 裸鼠体内移植

每只裸鼠皮下分别植入对照组、实验组1和实验组2的细胞-支架复合物各1个，共6只裸鼠。对照组植入左背上部，实验组1植入左背下部，实验组2植入右背下部。体内植入8周后取出进行检测。

1.8 相关评价指标的检测

对体外培养4周和体内培养8周的各组标本进行大体观察，包括新生组织的形态、大小和色泽，并进行称重。

阿利辛蓝比色法检测上述各组标本的糖胺多糖(GAG)含量。

将各组标本以 4%中性甲醛固定、石蜡包埋、切片。HE染色观察细胞基本形态和组织结构；甲苯胺蓝染色及 Safranin O 染色观察软骨组织的异染程度及基质中 GAG 的分泌情况；Ⅱ型胶原免疫组化染色观察各组标本Ⅱ型胶原表达情况。

应用生物力学分析仪对各组标本进行弹性模量检测，以最大负荷250 N、0.3 mm/min的位移速度加压，计算新生组织的弹性模量。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 残耳软骨细胞形态学观察

原代残耳软骨细胞约12～24 h贴壁，48 h后开始增殖。细胞刚贴壁时为圆形，伸展后呈多角形，类似于同源细胞群的生长方式形成独立的小群体，中央密集处可形成软骨样结节。一般8～10 d可达90%以上的汇合状态。传代后细胞生长速度加快，4 d即可接近汇合状态，可继续传代。残耳软骨细胞随传代出现伪足状细胞突起，呈现出更加明显的长梭形外观(图1)。

A：残耳软骨；B：残耳软骨细胞. A: Microtia ear cartilage; B: Microtia chondrocytes.图1 残耳软骨与残耳软骨细胞Fig. 1 Microtia ear cartilage and microtia chondrocytes

2.2 hADSCs形态观察

第三代超声辅助抽脂和常规负压抽脂获取的hADSCs接种48 h后都可见大部分细胞开始贴壁，为多角形的单层细胞,有的细胞体细长似成纤维细胞。72 h后大多数细胞贴壁，并开始伸展、分裂，呈梭形。5～7 d后细胞逐渐分裂、融合成单层并铺满底部。细胞平均传代扩增时间约为3 d，第3代细胞分裂增殖旺盛，细胞细长，排列紧凑且规律(图2)。

A：UAL和SAL抽脂部位；B：UAL提取的hADSCs；C：UAL和SAL抽取的脂肪；D: SAL提取的hADSCs A: Liposuction area of UAL and SAL; B: hADSCs obtained by UAL; C: Adipose tissue obtained by UAL and SAL; D: hADSCs obtained by SAL图2 通过UAL和SAL获取hADSCsFig. 2 hADSCs obtained by UAL and SAL

2.3 hADSCs的定向诱导分化

成脂诱导分化72 h后，镜下可见细胞立体感增强，细胞内有小脂滴出现，约1周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，诱导第11天时，细胞分化达到高峰，可见大量脂滴融合成团，油红O染色阳性，显示有大量脂质沉淀(图3B、E)。

A：SAL提取的hADSCs成骨分化；B：SAL提取的hADSCs成脂分化；C：SAL提取的hADSCs成软骨分化；D：UAL提取的hADSCs成骨分化；E：UAL提取的hADSCs成脂分化；F：UAL提取的hADSCs成软骨分化。 A: Osteogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; B: Adipogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; C: Chondrogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; D: Osteogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL; E: Adipogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL; F: Chondrogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL图3 hADSCs的鉴定Fig. 3 Identification of hADSCs

成骨诱导分化第4天时，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；第8天时胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间见钙质沉积；第12天时细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显；第14天时诱导分化达到高峰，可见大量钙沉积，并融合成片，茜素红染色阳性，呈红色结节(图3A、D)。

成软骨诱导分化24 h后，细胞呈小颗粒状漂浮在诱导液中，单个细胞形态无明显变化。随诱导时间延长，在密度较大处细胞逐渐聚集成群；诱导第7天即可在聚集细胞的表面看到微黄色的物质积累，量逐渐增多；诱导第21天时达到高峰，阿尔新蓝染色阳性(图3C、F)。

2.4 体外培养4周时的细胞-支架复合物的大体、组织学观察

体外培养4周后，大体观察可见3组细胞-支架复合物均形成了类软骨组织，呈微黄色、略有光泽，较薄。组织学观察可见对照组1、对照组2与实验组均未形成基质饱满的类软骨组织，组织结构疏松，类似细胞-材料复合物生长的早期阶段，仅有少量新生基质的生长包裹，呈现软骨特异性ECM沉积，仍有未降解的PGA支架材料。番红O染色、Ⅱ型胶原染色、甲苯胺蓝染色都可见稀少的新生基质，分别表现为淡染的红色、黄色、蓝色(图4)。

2.5 体内培养8周时的细胞-支架复合物的大体、组织学观察

体内培养8周后取材，大体观察可见3组细胞-支架复合物均形成了与原支架等大的类软骨组织，色微黄，触之有弹性。组织学观察显示，对照组1软骨组织不均一，大部分区域形成成熟的软骨组织，可见大量的软骨陷窝和细胞外基质分泌，但有部分区域组织结构疏松，软骨特异性ECM分泌较少；对照组2与实验组均形成成熟的软骨组织，结构均一，可见大量的软骨陷窝和细胞外基质分泌，支架材料已经完全降解。番红O染色、Ⅱ型胶原染色、甲苯胺蓝染色都显示强阳性(图5)。

2.6 细胞-支架复合物称重

对各组标本进行称重，结果显示对照组2与实验组均显著优于对照组1(P<0.05)，对照组2与实验组无显著差异(P>0.05)(图6 A)。

2.7 GAG含量检测

对各组标本进行GAG含量检测，结果显示对照组2与实验组均显著高于对照组1(P<0.05)，对照组2与实验组无显著差异(P>0.05)(图6B)。

图4 体外培养4周细胞-支架复合物大体、组织学观察。MC(对照组1)，Co-culture 1(对照组2)，Co-culture 2(实验组)Fig. 4 Gross view and histological observation of cell-scaffold complex after cultured 4 weeks in vitro. MC(ctrl group 1)， Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

图5 体内培养8周细胞-支架复合物大体、组织学观察。MC(对照组1)，Co-culture 1(对照组2)，Coculture 2(实验组)Fig. 5 Gross view and histological observation of cell-scaffold complex after cultured 8 weeks in vivo. MC(ctrl group 1)， Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

图6 体外培养4周和体内培养8周各组湿重、GAG含量、杨氏模量的比较。MC(对照组1)，Co-culture 1(对照组2)，Co-culture 2(实验组)Fig. 6 The comparisons of wet weight, GAG content and Young’s modulus among the 3 groups after cultured 4 weeks in vitro and 8 weeks in vivo. MC(ctrl group 1)，Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

2.8 生物力学检测

各组标本弹性模量检测结果显示，体外培养4周后，3组标本力学强度都很低，对照组2与实验组显著优于对照组1(P<0.05)，对照组2与实验组无差异(P>0.05)。但经过体内8周的重塑后，3组标本的弹性模量都有明显提升，对照组2与实验组显著优于对照组1(P<0.05)，对照组2与实验组无显著差异(P>0.05)(图6C)。

3 讨论

构建组织工程软骨耳郭最主要的问题是种子细胞的来源，小耳畸形患者的残耳软骨组织往往较小，不足以提供足量的残耳软骨细胞，而过度体外扩增将使软骨细胞逐渐失去表型及分泌软骨基质的能力，进而失去成软骨能力[10-11]。而ADSCs来源广、易获得、纯化率高、体外增殖速度快，是构建软骨组织的理想种子细胞。ADSCs成软骨细胞诱导的研究较多，但传统的诱导方法需要大量生长因子，难以应用于临床。研究发现，软骨微环境能有效促进干细胞成软骨分化，形成软骨样组织并用于修复缺损[12-13]。微环境可能的作用机制为：软骨细胞分泌 TGF-β、IGF 等生长因子，诱导干细胞向软骨方向分化[10]；相邻细胞间的相互作用[11]；分泌软骨微环境特异性细胞外基质，作用于细胞的增殖、分化、黏附及细胞间信号传导等。研究显示，残耳软骨细胞在体外独立模拟软骨诱导微环境，能够诱导ADSCs定向分化并形成软骨组织[14]。因此，本实验采用ADSCs和残耳软骨细胞共培养来构建软骨组织，湿重、糖胺多糖、生物力学检测都显示对照组2与实验组均显著优于对照组1，对照组2与实验组间无显著差异。组织学染色结果类似，对照组2与实验组形成的软骨组织结构均一，可见有大量的软骨陷窝和细胞外基质分泌，对照组1软骨组织不均一，有部分区域组织结构疏松，软骨特异性ECM分泌较少。由此推断，残耳软骨细胞微环境对ADSCs的软骨方向分化具有确切的促进作用，共培养组中的ADSCs能替代一定量的残耳软骨细胞形成软骨样组织。

超声辅助吸脂的基本原理是将电能转化为振动，引起热效应、空泡效应和机械效应，从而导致脂肪碎裂；超声能量会选择性地分解脂肪组织，对组织损伤较小，从而在减少出血的情况下实现抽脂。本实验中超声辅助吸脂和常规负压吸脂获得的ADSCs都可以进行成骨、成脂和成软骨分化，并且超声辅助吸脂和常规负压吸脂获得的ADSCs与残耳软骨细胞共培养都可以成功构建组织工程软骨，两者之间无显著差异，表明超声能量对ADSCs无不良影响。

综上所述，应用第三代超声辅助吸脂可以安全有效地获取ADSCs，超声能量对ADSCs无不良影响；应用第三代超声辅助抽脂获取的hADSCs+残耳软骨细胞共培养，可形成成熟的组织工程软骨。