姚琳 贾立涛 刘豫 曹谊林 周广东

组织工程软骨应用于整形外科时需满足创伤小、可塑性好等要求，可注射软骨应运而生[1]。目前，整形外科新兴的可注射软骨技术是软骨膜片技术[2]，软骨膜片技术利用大量软骨细胞培养而成，经匀浆化处理可用于微创隆鼻、下巴填充或面部凹陷填充，具有不依赖支架材料、可塑性好等优点，但需要大量软骨细胞，且培养、制备成本极高。

微载体因培养空间利用效率高且能实现可注射而备受关注[3]，但在组织工程与整形美容领域的应用尚未见报道。本研究将软骨细胞接种于微载体后体外动态培养，探索真皮脱细胞基质微载体构建可注射软骨的可能性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

真皮脱细胞基质微载体(江苏优创医学科技有限公司)，采用猪真皮细胞外基质为原料，经病毒灭活与脱细胞等工艺制备而成，为一种多孔性的三维网状结构，粒径≤3 mm。

1.2 实验动物

健康雄性裸鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)12只，5～7周龄，随机分为实验组与对照组(n=6)。健康山羊(上海甲干生物科技有限公司)，雌雄不限，8月龄，用于软骨细胞的获取。

1.3 实验器材和试剂

胶原酶(Sigma公司，美国)；高糖DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素-两性霉素B(Gibco公司，美国)；苏木素-伊红染色试剂、番红固绿染色液(武汉赛维尔生物技术有限公司)。3D FloTrix miniSpin 生物反应器(3D FTmS-1-4，北京华龛生物科技有限公司)。

1.4 实验方案设计

将分离消化培养得到的软骨细胞与真皮脱细胞基质微载体混合，实验组置于3D生物反应器中动态培养，对照组采用静态培养。体外培养4周后注射入裸鼠皮下，8周后取材，检测成软骨指标。

1.5 实验方法

1.5.1软骨细胞获取

在无菌操作台中分离获取山羊耳软骨，置于0.15%胶原酶中震荡消化8 h。滤网过滤消化后的混悬液，1 500 r/min离心混悬液5 min，弃上清，细胞沉淀用含10%血清和1%抗生素的高糖DMEM培养基重悬，以1×105cells/mL的密度接种于培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.5.2材料准备

将真皮脱细胞基质微载体置于含10%血清和1%抗生素的高糖DMEM培养基中预培养，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。

1.5.3体外培养及观察指标

将体外培养后的软骨细胞8×107个接种于4 g微载体中，同时加入40 mL含10%血清和1%抗生素的高糖DMEM培养基，混合培养24 h后行电镜观察。将以上混合培养物平均分为两组，实验组置于125 mL生物反应器瓶中，将生物反应器瓶放在3D FloTrix miniSpin生物反应器底座上，置于37 ℃、5%CO2培养箱中动态培养4周；对照组置于50 mL离心管中，于37 ℃、5% CO2培养箱中静态培养4周。体外培养2周、4周时分别取少量混合物在扫描电镜下观察。体外培养4周后取少量样品进行活死细胞染色，染色后在共聚焦显微镜下观察。

1.5.4体内培养及观察指标

体外培养4周后，将微载体与细胞形成的团状物取出，PBS清洗3次，将团状物剪碎成颗粒状，灌装至1 mL注射器中，使用注射器将各组混合物0.5 mL注射到各组裸鼠皮下。体内培养8周后取材，进行大体观察、HE染色、番红固绿染色。

2 结果

2.1 微载体性状特征

真皮脱细胞基质微载体以猪真皮细胞外基质为原料，呈颗粒状，粒径≤3 mm。光镜下见微载体呈不规则团状，平均直径约3 mm，内部可见纤维形态。电镜观察结果与光镜观察结果一致(图1)。

2.2 体外培养观察

细胞接种于微载体后混合培养24 h，使细胞与微载体充分接触，24 h后可见细胞附着于微载体上，完成细胞贴壁。实验组与对照组分别动态与静态培养2周后，电镜显示实验组软骨细胞附着于微载体后大量增殖，并分泌细胞外基质，形成明显聚团现象；对照组软骨细胞附着于微载体后同样发生增殖并分泌基质，但聚团现象不明显。体外培养4周后电镜观察显示，实验组细胞增殖聚团更明显，质韧，初步呈现软骨特征；对照组软骨基质分泌多，覆盖微载体表面。体外培养4周的活死细胞结果显示，实验组软骨细胞活力较好，与微载体结合更充分，细胞进入微载体内部；对照组结合于微载体表面(图2)。

A、B：微载体大体观；C：微载体电镜下形态；D：微载体光镜下形态 A, B: General view of cytodex; C: Cytodex morphology under electron microscope; D: Cytodex morphology under light microscope图1 微载体形态Fig. 1 Morphology of cytodex

A：动态培养环境；B：体外动态培养2周电镜下形态；C：体外动态培养4周电镜下形态；D：静态培养环境；E：体外静态培养2周电镜下形态；F：体外静态培养4周电镜下形态；G：细胞接种微载体24 h电镜下形态；H：体外动态培养4周活死细胞染色结果；I：体外静态培养4周活死细胞染色结果 A: Dynamic culture environment; B: Morphology under electron microscope after 2 weeks of dynamic culture in vitro; C: Morphology under electron microscope after 4 weeks of dynamic culture in vitro; D: Static culture environment; E: Morphology under electron microscope after 2 weeks of static culture in vitro; F: Morphology under electron microscope after 4 weeks of static culture in vitro; G: Morphology under electron microscope after cells inoculated with cytodex for 24 hours; H: Results of live-dead cell staining after 4 weeks of dynamic culture in vitro; I: Results of live-dead cell staining after 4 weeks of static culture in vitro图2 体外培养观察Fig. 2 Observation of culture in vitro

2.3 体内培养观察

经体外培养4周后，实验组与对照组分别注射入裸鼠皮下。体内培养8周后取材，可见两组均形成了软骨样组织块，实验组的组织块呈白色，表面光滑，质硬有弹性；对照组的组织块呈白色略黄，表面光滑，质硬但略软于实验组，弹性尚可(图3)。

HE与Safranin-O染色结果显示，两组组织块均出现软骨陷窝，实验组的组织块中心部分软骨陷窝较为连续，周围部分胞外基质环绕，形成较为成熟的软骨组织；对照组的组织块软骨陷窝呈岛状，结缔组织与胞外基质分布较多(图4)。

A：实验组裸鼠体内组织块；B：对照裸鼠体内组织块 A: Tissue in nude mice of experimental group; B: Tissue in nude mice of control group图3 体内培养大体观察Fig. 3 General observation of culture in vivo

A：实验组HE染色；B：对照组HE染色；C：实验组番红固绿染色；D：对照组番红固绿染色 A: HE staining in the experimental group; B: HE staining in the control group; C: Safranin-O staining in the experimental group; D: Safranin-O staining in the control group图4 体内培养组织学观察(4×)Fig. 4 Histological observation of culture in vivo (4×)

3 讨论

利用组织工程学基本原理，体外构建软骨，是实现软骨再生的新方法[4-6]。可注射软骨因创伤小、易操作、塑形效果好等优点成为整形外科领域的研究热点[1]。可注射软骨的构建需要大量种子细胞，种子细胞在扩增过程中，随着代次增高，会逐渐呈现老化的现象，丧失软骨细胞特征性表型[7]。本研究使用的真皮脱细胞基质微载体具有极高的比表面积，相较于平面培养可以节约大量种子细胞[8]。且微载体具备一定的形态和力学支撑，可以满足动态培养的需求。

软骨构建需要一定的力学刺激，适当的静水压有助于维持软骨的表型和功能[9-11]。本研究中，我们利用培养瓶持续搅拌，维持动态环境培养4周，同时将对照组置于离心管内静止培养。结果显示，相较于对照组，实验组细胞与微载体结合更充分，细胞进入微载体内部；体内培养8周的结果显示，虽大体观两组无明显差异，但组织学可见实验组软骨形成更成熟。研究表明，动态培养系统能够模拟正常组织微环境[12]，本实验证实动态环境所提供的压力，有助于细胞与微载体的接触以及细胞外基质的分泌，即有助于微载体构建软骨。

本实验使用不具备免疫功能的裸鼠，对于具有免疫功能的大动物，其体内成软骨的情况尚有待研究，下一步我们将对大动物进行相关探索，进一步证实真皮脱细胞微载体的软骨构建功能。

4 结论

真皮脱细胞基质微载体复合软骨细胞可以实现可注射软骨的构建，且动态培养效果优于静态培养。