黄华花，王明军，吕诗诗，王圣江，王晓莹

厦门市中药生物工程重点实验室/福建省中药精加工与健康产品开发重点研究室/厦门医学院药学系（厦门 361023）

金橘是芸香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的成熟果实，药食同源，应用广泛，常鲜食，也可制成果脯、罐头、果糕、果汁饮料等食用[1-4]，甚至被开发成保健食品如金桔利口酒、金枣丹、金桔咀嚼片等[5-7]，金橘是一种具有很大开发潜力的药用保健资源。现代研究表明[8-12]，金橘具有抗炎镇痛、化痰止咳、调节免疫、预防结石、解酒保肝、调节胃肠运动等作用，黄酮为其活性部位[13-14]，但具体的活性成分尚不明确，限制了金橘的深度开发利用。金橘苷仅在金橘中有过报道，为黄酮类成分，且含量最高，可能为金橘的活性成分。在前期对金橘中金橘苷的提取工艺进行研究基础上，试验采用硅胶柱色谱法对金橘苷进行分离纯化，在单因素考察基础上，以金橘苷提取率和纯度为考察指标，以洗脱剂比例、上样量、硅胶量、柱直径为考察因素，利用Box-Behnken响应面法对金橘苷的纯化工艺进行优化，该工艺可为金橘的深度研究及产业化应用提供技术参考和依据。

1 材料

1.1 材料与试剂

金橘，采集于广西桂林阳朔，由厦门医学院药学系鲍红娟副教授鉴定为Fortunella margarita（Lour.）Swingle的干燥成熟果实。切片，去核，阴干，粉碎，过60目筛，备用。

金橘苷对照品（批号Q14M10Q73839，纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司）；柱层析硅胶（100～200目，青岛海洋化工有限公司）；氯仿、甲醇、磷酸（均为分析纯）；乙腈（色谱纯）；超纯水。

1.2 仪器与设备

H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CPA225D、BS224S型电子天平（德国Sartorius公司）。

2 方法与结果

2.1 金橘苷纯化

2.1.1 粗品的制备

取金橘粉末40 g，按料液比1∶50（g/mL）加入90%甲醇，超声（功率900 W，频率40 kHz）处理30 min，滤过，浓缩至100 mL，即得。

2.1.2 纯化方法

精密吸取一定体积的2.1.1的粗品于蒸发皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅胶，混匀，蒸干，粉碎，得负载样品硅胶。称取一定量硅胶（100～200目），湿法装入一定直径的层析柱内，干法上样，加入大量一定比例的洗脱剂进行洗脱，按相同体积将洗脱液收集于事前已编好号的收集瓶内，回收溶剂，作为过柱后的各供试品。

2.2 金橘苷的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

取金橘苷对照品适量，精密称定，加90%甲醇溶解并制成质量浓度0.262 5 mg/mL的对照品贮备液。吸取对照品贮备液4 mL置于25 mL量瓶中，加90%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

过柱前的供试品溶液的制备。取2.1.1的粗品0.5 mL，置于10 mL量瓶中，加90%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

过柱后的供试品溶液的制备。取2.1.2的供试品，精密加入90%甲醇1.5 mL溶解，滤过，即得。

2.2.3 色谱条件

图1 UPLC色谱图

色谱柱，Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，15% A→45% A；5～8 min，15% A）；流速0.3 mL/min；检测波长333 nm；进样量2 μL。在此色谱条件下，理论板数按金橘苷计不低于5 000，相邻峰间分离度均大于1.5，基线分离良好，色谱图见图1。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.1的对照品贮备液1，2，4，8和16 mL稀释至25 mL，得系列标准品溶液。按2.2.3的色谱条件进样分析，以峰面积对质量浓度（mg/mL）进行回归分析，得回归方程为Y=1.453×107X+1.088×104，r=0.999 9，线性范围为10.5～168.0 μg/mL。

2.3 金橘苷提取率和纯度计算

将2.2.2的各供试品溶液按2.2.3的色谱条件进样分析，按面积归一化法，将纯度大于60%的各供试品溶液合并，计算提取率和纯度。

式中：m为过柱后合并的纯度大于60%的供试品溶液中金橘苷质量，mg；M为过柱前的供试品溶液中金橘苷质量，mg。

金橘苷的纯度为合并的纯度大于60%的供试品溶液按2.2.3的色谱条件进样分析后，通过积归一化所得的纯度。

2.4 单因素设计试验

2.4.1 洗脱剂对金橘苷提取率和纯度的影响

精密吸取2.1.1的粗品2 mL，共5份，分别置于蒸发皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅胶，混匀，蒸干，粉碎，得负载样品硅胶。称取10 g硅胶，共5份，分别湿法装柱（柱直径1.5 cm），干法上样，分别以氯仿-甲醇-水比例（1∶1∶0.1，2∶1∶0.1，3∶1∶0.1，4∶1∶0.1和5∶1∶0.1）进行洗脱，按相同体积收集洗脱液，回收溶剂，按2.2.2的方法制备过柱后的供试品溶液，按2.2.3的色谱条件进样分析，记录峰面积并计算金橘苷提取率和纯度，结果见图2。随着洗脱剂中氯仿比例增加，金橘苷提取率和纯度均不断增加，其中洗脱剂比例1∶1∶0.1时，金橘苷提取率和纯度均很低，洗脱剂比例5∶1∶0.1时金橘苷提取率和纯度与比例4∶1∶0.1时差异不大，但洗脱速度很慢，消耗大量洗脱剂，因此确定洗脱剂比例2∶1∶0.1，3∶1∶0.1和4∶1∶0.1作为响应面的3个水平。

2.4.2 上样量对金橘苷提取率和纯度的影响

分别精密吸取2.1.1的粗品1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL共5份，置于蒸发皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅胶，混匀，蒸干，粉碎，得负载样品硅胶。称取10 g硅胶，共5份，湿法装柱（柱直径1.5 cm），分别将上述样品干法上样，加入氯仿-甲醇-水比例3∶1∶0.1的洗脱剂进行洗脱，按相同体积收集洗脱液，回收溶剂，分别按2.2.2的方法制备过柱后的供试品溶液，按2.2.3的色谱条件进样分析，记录峰面积并计算金橘苷提取率和纯度，结果见图3。随着上样量增加，金橘苷提取率和纯度先增加后降低，且在上样量2.5 mL时，达到最高值，因此确定上样量2.0，2.5和3.0 mL作为响应面的3个水平。

图2 洗脱剂对金橘苷提取率和纯度的影响

图3 上样量对金橘苷提取率和纯度的影响

2.4.3 硅胶量对金橘苷提取率和纯度的影响

精密吸取2.1.1的粗品2 mL，共5份，分别置于蒸发皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅胶，混匀，蒸干，粉碎，得负载样品硅胶。分别称取5.0，7.5，10.0，12.5和15.0 g硅胶，湿法装柱（柱直径1.5 cm），干法上样，加入氯仿-甲醇-水比例为3∶1∶0.1的洗脱剂进行洗脱，按相同体积收集洗脱液，回收溶剂，分别按2.2.2的方法制备过柱后的供试品溶液，按2.2.3的色谱条件进样分析，记录峰面积并计算金橘苷提取率和纯度，结果见图4。随着硅胶量增加，金橘苷提取率和纯度先增加后降低，且在硅胶量10 g时，达到最高值，因此确定硅胶量7.5，10.0和12.5 g作为响应面的3个水平。

2.4.4 柱直径对金橘苷提取率和纯度的影响

精密吸取2.1.1的粗品2 mL共5份，分别置于蒸发皿中，按1∶0.3（mL/g）的比例加入硅胶，混匀，蒸干，粉碎，得负载样品硅胶。称取10 g硅胶5份，湿法装于直径分别为1，1.5，2.0，2.5和3.0 cm的层析柱内，干法上样，加入氯仿-甲醇-水比例3∶1∶0.1的洗脱剂进行洗脱，按相同体积收集洗脱液，回收溶剂，分别按2.2.2的方法制备过柱后的供试品溶液，按2.2.3的色谱条件进样分析，记录峰面积并计算金橘苷提取率和纯度，结果见图5。随着柱直径增加，金橘苷提取率和纯度逐渐降低，因此确定柱直径1.0，1.5和2.0 cm作为响应面的3个水平。

图4 硅胶量对金橘苷提取率和纯度的影响

图5 柱直径对金橘苷提取率和纯度的影响

2.5 Box-Behnken试验设计及结果

2.5.1 Box-Behnken试验设计

以单因素考察为基础，确定了考察因素及各因素的取值，见表1。根据Box-Behnken进行响应面试验设计，方案及结果见表2。

表1 因素与水平

2.5.2 综合评分的计算

将表2中金橘苷提取率X1、金橘苷纯度X2的数据进行线性插值处理Z=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）后计算综合评分Y，结果见表3。

式中：Z1为金橘苷提取率变换后的指标值；Z2为金橘苷纯度变换后的指标值。

2.5.3 响应面模型的建立及方差分析

运用Design Expert 8.0.6进行回归分析，拟合得到综合评分（Y）对A（洗脱剂比例）、B（上样量）、C（硅胶量）和D（柱直径）的回归方程为：Y=0.73+0.21A-0.046B+0.11C-0.11D+0.020AB-0.087AC-0.15AD-0.041BC+0.056BD+7.283×10-3CD-0.078A2-0.052B2-0.11C2-0.14D2。对该模型进行方差分析，结果见表4。

由表4可知，该模型差异极显著（p＜0.000 1），失拟项不显著（p=0.102 6，p＞0.05），R2=0.932 8，说明该模型拟合程度好，回归方程适合用于检验结果。回归方程各项方差分析表明，一次项A、C、D的影响极显著（p＜0.01），B的影响不显著；二次项C2、D2的影响极显著（p＜0.01），A2的影响显著（p＜0.05），B2的影响不显著；交叉项AD的影响极显著（p＜0.01），AC的影响显著（p＜0.05），AB、BC、BD、CD的影响不显著。由F可知，4个因素对Y的影响大小依次为：A＞D＞C＞B。通过舍去不显著项得到优化模型方程为Y=0.73+0.21A+0.11C-0.11D-0.087AC-0.15AD-0.078A2-0.11C2-0.14D2。

2.5.4 交互效应分析

为进一步考察4个因素中交互作用对综合评分的影响，运用Design Expert 8.0.6软件绘制三维曲线图，其中AC、AD之间的交互作用对综合评分的影响显著，与方差分析的结论相一致，见图6。

表2 响应面试验设计及结果

表3 变换后的指标值及综合评分

表4 回归模型的显著性检验及方差分析

图6 交互效应图

2.5.5 最佳工艺条件的确定与验证

Design Expert 8.0.6软件分析得到金橘苷的最佳纯化条件为洗脱剂比例4∶1∶0.1、上样量2.06 mL、硅胶量10.56 g、柱直径1 cm，在此条件下，金橘苷取率和纯度的综合评分为1.023 4。为检验所得工艺的可靠性，进行验证试验。为了实际操作方便，对验证时的工艺条件四舍五入得洗脱剂比例4∶1∶0.1、上样量2.1 mL、硅胶量10.6 g、柱直径1 cm，在此条件下进行3次平行试验，具体结果见表5。由结果可知，测得的金橘苷提取率和纯度的综合评分为1.000 5（RSD=1.09%，n=3），与预测值相比偏差为2.24%，二者比较接近，表明模型合理可靠，预测性好，可以采用此工艺对金橘苷进行纯化。

表5 验证试验结果（n=3）

3 结论与讨论

3.1 结论

试验以单因素考察为基础，利用响应面法设计优化金橘苷的纯化工艺，得到4个因素对金橘苷提取率和纯度影响的大小依次为：洗脱剂比例＞柱直径＞硅胶量＞上样量。优化所得最佳纯化工艺条件为：氯仿-甲醇-水4∶1∶0.1、上样量2.1 mL、硅胶量10.6 g、柱直径1 cm。此工艺稳定、可靠，可较好地纯化金橘苷，为金橘的深度研究及产业化应用提供技术参考和依据。

3.2 讨论

3.2.1 粗品制备方法的确定

前期已对金橘中金橘苷的提取工艺进行了研究，以甲醇浓度、提取温度、提取时间和料液比为考察因素，采用响应面法优化金橘苷的提取工艺，所优化的提取工艺条件为：甲醇体积分数90%、料液比1∶50（g/mL）、超声提取30 min、提取温度25 ℃。因此，试验以此条件进行粗品的制备。

3.2.2 硅胶目数的考察

在预试验中，考察硅胶目数对金橘苷分离效果的影响，分别以100～200、300～400目硅胶为填料进行金橘苷的纯化。结果发现，采用300～400目硅胶为填料时，洗脱剂的流速非常慢，洗脱时间长，且金橘苷提取率和纯度与采用100～200目硅胶为填料时差异不大，因此，试验采用100～200目硅胶为填料进行金橘苷的纯化。

3.2.3 拌样硅胶量的确定

在预试验中，考察湿法上样和干法上样的效果，发现干法上样金橘苷的纯化效果较好，对干法上样时拌样硅胶量进行考察，分别考察1∶0.1，1∶0.3和1∶0.5（mL/g）的拌样硅胶量。结果发现，拌样硅胶量1∶0.1时，负载样品硅胶太硬，粉碎困难，且损失较大，而拌样硅胶量1∶0.5时，上样后样品层太厚，纯化效果差，因此，试验最终确定1∶0.3的拌样硅胶量。