闫丹丽，邹依婷，李 默，王一然，陈 旭，武俊瑞

（沈阳农业大学 食品学院，沈阳110161）

酸奶是以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌（德氏乳杆菌保加利亚亚种）发酵制成的产品[1]。近年来，随着酸奶口味和种类的不断丰富，消费者对酸奶品质的要求也日益增高[2]。发酵剂是影响酸奶品质的因素之一，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等乳酸菌是最常见的发酵剂[3]，在发酵剂作用下牛奶中的乳糖被转化成乳酸[4]，乳中酪蛋白在酸性环境下形成三维凝胶网状结构[5]，对酸奶的凝胶特性产生影响[6]，进而影响酸奶品质。氧气是影响酸奶品质的重要因素之一[7]，绝大多数乳酸菌属于厌氧菌或者兼性厌氧菌，厌氧条件更有利于乳酸菌的生长繁殖和积累代谢产物[8-10]。目前，市售酸奶常有粘稠度低、持水力差、组织状态粗糙、乳清结块析出等问题，进而影响酸奶品质。酸奶生产企业虽在发酵罐内发酵酸奶，然而实际上许多企业由于设备技术等原因并不能达到完全厌氧的生产条件，因此发酵菌种的发酵作用不能充分发挥，厌氧发酵与酸奶品质的关系还未被完全摸索和探究。

本研究前期试验发现乳酸菌发酵剂在厌氧条件下的生长繁殖状况和产酸速度都要显著优于有氧发酵，在前期工作的基础上，基于Shellab BACTRON厌氧操作平台，针对在厌氧条件下保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为混合发酵剂接种发酵酸奶质构特性、微观结构和流变学特性进行深入探讨，综合评价厌氧发酵对酸奶品质产生的影响，以期为酸奶的精细化生产和品质优化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料乳（市售）；嗜热链球菌（法国DANISCO公司）；保加利亚乳杆菌（法国DANISCO公司）；琼脂、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、无水葡萄糖等试剂（国药集团）。

1.2 仪器与设备

Shellab BACTRON厌氧操作平台 （美国Shellab公司）；5424R高速台式离心机离心机 （德国艾本德股份公司）；DHR旋转流变仪、TA.new plus质构仪（美国TA仪器公司）；Regulus8100共聚焦扫描电镜（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌在有氧和厌氧条件下生长曲线的绘制 将冻干保存的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌分别用MRS液体培养基活化3代，取2%第3代菌液接种于MRS液体培养基中，分别在有氧和厌氧条件下培养48h，每隔2h检测其活菌数、菌液吸光值（OD600nm）和pH值，并以培养时间为横坐标，活菌数、菌液吸光值OD600nm和pH值为纵坐标分别绘制两株乳酸菌在有氧和厌氧培养条件下的生长曲线和pH值变化曲线。

1.3.2 有氧和厌氧发酵酸奶样品的制备 参照王越男等[11]方法制备有氧和厌氧发酵酸奶样品，将原料乳经过滤和标准化后，在20MPa条件下均质，然后在90℃下杀菌5min。在厌氧操作台（2min内达到厌氧条件）中将其迅速降温到37℃，添加5%的蔗糖并迅速搅拌均匀，接种0.003%保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌1∶1混合的发酵剂。再将其转移至厌氧培养箱中于42℃条件下发酵至酸度为70°T。迅速冷却到20℃，最后将发酵好的酸奶置于4℃后熟12h，即厌氧发酵酸奶样品（整个过程都是在厌氧条件下完成）。在正常有氧条件下完成接种，并放入恒温恒湿培养箱于42℃条件下发酵至酸度为70°T。迅速冷却到20℃，最后将发酵好的酸奶置于4℃后熟12h，即有氧发酵酸奶样品。

1.3.3 厌氧发酵对酸奶持水力影响的测定 参照刘梦云[6]所述方法测定酸奶的持水力，分别取有氧和厌氧发酵酸奶样品20g放入离心管中，用低温离心机5000r·min-1离心5min，静置10min，除去上清液，按照以下公式计算样品的持水力。

式中：m1为离心管质量；m2为酸奶和离心管质量；m3为除去上清液后酸奶和离心管质量。

1.3.4 厌氧发酵对酸奶质构特性影响的测定 按照SUPAVITITPATANA等[12]描述的方法测定酸奶样品的质构特性。分别取有氧发酵和厌氧发酵后熟完成后的酸奶样品50mL，利用质构分析仪和直径为2.5cm的平底圆柱形探针进行分析，测试前的速率为5.0mm·s-1，测试速率2.0mm·s-1进入酸奶样品20mm的深度，测试样品被压缩两次，间隔时间为5s。记录待测样品的硬度、粘力、弹性、胶着性、咀嚼性指数。试验重复3次。

1.3.5 厌氧发酵对酸奶微观结构影响的测定 利用扫描电镜检测有氧和厌氧发酵酸奶微观结构的变化情况，将适量样品用双面胶固定、喷金，高真空模式下进行扫描电子显微镜测定，工作电压30kV，每个样品重复操作3次。

1.3.6 厌氧发酵对酸奶流变特性影响的测定 取待测酸奶样品适量于流变仪的水平板表面上并修剪掉过量的样品，参照丁琦[13]方法，利用流变仪测定有氧和厌氧发酵酸奶的表观黏度、触变性和黏弹性。

1.4 数据处理与分析

每组试验重复3次，利用Origin Pro 8.5和SPSS 16.0软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌在有氧和厌氧条件下的生长曲线

由图1可知，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在有氧和厌氧条件下生长趋势存在差异，氧气存在与否不仅对两菌株的生长产生干扰，而且对其产酸速率和最终pH值产生影响。厌氧条件更有利于嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长繁殖，对其产酸也有一定的促进作用。

图1 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在有氧和厌氧条件下的生长曲线和pH值变化情况Figure 1 Growth curve and pH change of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus under aerobic and anaerobic conditions

2.2 厌氧发酵对酸奶持水力的影响

持水力（WHC）是衡量酸奶品质的一个重要指标[14]，持水力越高酸奶的组织状态和稳定性越好[15]，较高的持水力也会使酸奶的口感更好。由图2可知，厌氧发酵酸奶的持水力[（68.42±0.55）%]显著高于有氧发酵酸奶[（63.57±0.67）%]（p＜0.05）。

2.3 厌氧发酵对酸奶质构特性的影响

由表1可知，有氧和厌氧发酵条件下酸奶的硬度、弹力、弹性与咀嚼性没有显著变化（p＞0.05），粘力和胶着性存在显著差异（p＜0.05）。说明厌氧发酵不会影响酸奶的硬度、弹力、弹性以及咀嚼性。但与有氧发酵相比，厌氧发酵酸奶胶着性和粘力显著增大（p＜0.05），分别为0.86N和0.43N。说明在厌氧条件下，乳酸菌发酵酸奶的粘稠度增加。

图2 氧气条件对酸奶持水力的影响Figure 2 Effect of oxygen condition on the water holding capacity of yoghurt

表1 有氧和厌氧发酵酸奶质构特性Table 1 Texture characteristics of aerobic and anaerobic fermented yoghurt

2.4 厌氧发酵对酸奶微观结构的影响

由图3a和图3b可知，出厌氧和有氧发酵均可以看到表面致密的蛋白质凝胶结构，有氧发酵酸奶表面明显可见较大的酪蛋白聚集物，厌氧发酵的酸奶表面聚集物形成的结构比有氧组稍小，结构相对更加细致、均匀。由图3c和图3d可知，厌氧条件发酵的酸奶网状结构更加紧密，更加完整均匀，中间连接的丝状物较粗，较稳固。与其相比，有氧组酸奶的网状结构部分没有紧密结合，中间连接的丝状物较长，且较细。该结果表明厌氧发酵的酸奶具有更细致的表面结构和更加稳固、均匀的内部网状结构。

图3 有氧和厌氧发酵酸奶扫描电子显微镜构结构Figure 3 Structure of aerobic and anaerobic fermented yogurt by scanning electron microscope

2.5 厌氧对乳酸菌发酵酸奶流变特性的影响

2.5.1 厌氧条件对酸奶表观黏度及剪切应力的影响表观黏度是流变学测定的指标之一，可侧面反映酸奶的结构和稳定性[16]，厌氧和有氧发酵酸奶的表观黏度随剪切速率变化情况如图4。由图4可知，有氧和厌氧发酵酸奶的表观黏度随着剪切速率的增加都逐渐下降，组织状态变稀，又随着剪切速率的降低而逐渐增加，而厌氧发酵酸奶的表观黏度始终高于有氧发酵酸奶，说明在厌氧发酵条件下，酸奶的结构和稳定性更好。此外，有氧和厌氧发酵酸奶的表观黏度随剪切速率的变化升速和降速曲线并未出现完全重合，降速曲线都出现了不同程度的滞留现象，说明在剪切作用下，两种条件发酵酸奶的结构不能完全恢复，结构都受到一定的破坏，而有氧发酵酸奶降速曲线的滞留程度明显大于厌氧发酵酸奶，说明厌氧发酵酸奶的结构更紧密，恢复程度更好。

酸奶的触变性是指酸奶受到机械力的作用下，分散体系中的粘度和剪切力随作用时间变化的一种流动学状态[17]，触变性流体在变速剪切过程中，升速曲线和降速曲线之间不完全重合，形成触变环，触变环面积的大小可以用来衡量酸奶受机械破坏后的恢复能力，面积越大说明恢复速度慢，面积越小说明恢复速度快[18]。有氧和厌氧发酵酸奶的剪切应力随剪切速率变化如图5。由图5可知，有氧和厌氧发酵酸奶的剪切应力都随着剪切速率的升速而增加，随着剪切速率的降速而降低，而厌氧发酵酸奶的剪切应力明显高于有氧发酵酸奶，说明厌氧发酵酸奶的粘度更大，稳定性更强。从升速和降速曲线在不同发酵条件下形成的触变环面积来看，有氧发酵酸奶的触变环面积（34.37Pa·s-1）大于厌氧发酵酸奶的触变环面积（22.65Pa·s-1）（p＜0.05），说明厌氧发酵酸奶的恢复性更好，结构更稳定。

2.5.2 氧气条件对酸奶粘弹性的影响 弹性模量G′和粘性模量G″是衡量酸奶粘弹性的重要指标[19]，可用来表征样品发生弹性形变所需的力度和流动时所需的摩擦力[20]。有氧和厌氧发酵酸奶的粘弹性随频率扫描（0.1～10Hz）变化如图 6。

由图6可知，有氧和厌氧发酵酸奶样品的G′和G″都随着扫描频率的增加，且G′始终高于G″，说明两种发酵方式下的酸奶都呈现出类固体的特征。厌氧发酵酸奶的G′和G″都要高于有氧发酵酸奶，说明厌氧发酵酸奶具有更强的凝胶结构，组织状态更加稳定。

图4 表观黏度随剪切速率变化Figure 4 Apparent viscosity varies with shear rate

图5 剪切力随剪切速率变化Figure 5 Shear force varies with shear rate

图6 酸奶粘弹性变化情况Figure 6 Changes of viscoelasticity of yogurt

3 讨论与结论

有研究显示，乳酸菌产生的胞外多糖能够与酸奶中的结合水、蛋白质及胶粒等相互作用，有效地防止酸奶脱水收缩，水分流失，提高酸奶的持水性[20-22]。不同的发酵条件能够显著影响乳酸菌胞外多糖的分泌[23]，产生这种现象的原因可能是在厌氧条件下，乳酸菌的生长代谢旺盛，分泌的胞外多糖等代谢产物增多，并与酸奶中蛋白质形成更致密的网状结构，进而使持水力增加。有研究表明，乳酸菌发酵过程中产生的胞外多糖等粘状物是影响酸奶质构的重要因素[24]。产生这种现象的原因可能是在厌氧条件下，乳酸菌产生胞外多糖增多，使酸奶的交联度增加，进而增加酸奶的粘度。

不同的处理条件会对巴氏杀菌乳贮藏过程中的蛋白质结构产生显著影响，可合理推测发酵条件会对酸奶中蛋白质的结构产生影响。乳酸菌分泌的丝状多糖能与蛋白质相连形成更加紧密的网状结构，这种网状结构不仅可以改善酸奶的流变学特性，还能防止乳清析出，提高酸奶粘度，改善酸奶口感[26-28]。在本研究中，厌氧发酵下乳酸菌的生长代谢更加旺盛，产生更多的胞外多糖等代谢产物，与蛋白质交联形成更细致的网状结构，这一结果与酸奶持水力结果相符。

RUAS-MADIEDO等[29-30]研究证明，乳酸菌产生的胞外多糖可以作为乳制品质地的改良剂，能够增加乳制品的黏度，还能与乳制品中的蛋白质胶粒相互作用，增加蛋白质网状结构的刚性和稳定性。酸奶黏度亦可受蛋白质水合作用影响[31]。在本研究中，厌氧发酵酸奶的表观黏度和所需的剪切应力高于有氧发酵酸奶，可能是由于厌氧发酵促进了乳酸菌胞外多糖分泌增多，进而使酸奶的黏度增加，也有可能是由于厌氧发酵促进了发酵菌种产酸，有利于蛋白质水合作用，使蛋白质网状结构的韧性和稳定性增强。

有研究表明，乳酸菌胞外多糖可以与酪蛋白相互作用时可充当活性填料并使酸奶的黏弹性模量增加[32]。本研究中，厌氧发酵可能促进乳酸菌产生的胞外多糖等代谢产物增多，与蛋白质之间的作用增强，进而使其黏弹性模量增加。

有氧发酵和厌氧发酵这两种不同发酵方式会对酸奶品质产生不同的影响，厌氧发酵条件可以促进乳酸菌发酵剂的生长繁殖，增加代谢产物的积累，这有利于酸奶中的酪蛋白质形成更致密、均匀的网状结构。厌氧发酵能够显著提高酸奶的持水力、粘力、胶着力、表观黏度、粘弹性和触变性，这说明厌氧发酵条件更有利于酸奶致密凝胶结构的形成和改善酸奶的流变学特性，使酸奶保持更稳定的状态。这可为我国乳品企业提升酸奶品质提供参考，以满足消费者对于酸奶品质的需求。