黄小兰，周祥德，杨 勤，张椿翊，何旭峰，周 浓

(1.重庆三峡学院 生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404100；2.重庆市万州食品药品检验所，重庆 404100；3.重庆三峡医药高等专科学校 中医学院，重庆 404100)

地参为唇形科地笋属植物毛叶地笋(Lycopuslucidusvar.hirtusRegel)的干燥根茎，其性平味甘，有化瘀止血、益气利水之功效[1]，是我国名贵的中草药，其药用价值在多部古籍中均有介绍。《本草拾遗》记载其具有利九窍、通血脉、排脓、治血等作用；《嘉佑本草》记载其能主治一切血病；《四川常用中草药》中记载其具有调和气血、补精髓、治头晕的作用[2]；现代其作为中药材收载于2009版《湖南省中药材标准》[3]。地参不仅有较高的药用价值，而且还颇具营养价值，其饱满脆嫩的根茎因营养丰富、味道鲜美而享有“蔬菜珍品”之美誉，是一种传统的药食兼用佳品[4-5]。

研究表明，地参含有丰富的糖类、氨基酸、粗蛋白、矿物元素和维生素等营养物质，地参中的总糖含量高达干重的40%以上，是其加工开发的主要利用物质[6-7]。糖类物质是植物通过光合作用合成，为自然界中一切生命体提供能量来源，是生命活动不可或缺的物质基础[8]。其中的多糖类成分更是因其在药理方面的突出作用而备受关注，王文静等[9]发现不同采收期的地参多糖具有较强的抗氧化作用；熊伟等[10-11]在将精制的野生地参多糖灌胃给正常和糖尿病小鼠的实验中发现，地参多糖具有较好的降血糖、降血脂作用；Yang等[12]研究了地参凉茶的多糖组成及其在改善免疫系统方面的显著作用。目前，对地参中糖类物质的研究主要集中在多糖的提取测定以及生物活性方面[9-14]，尚未见其他糖类物质的系统性研究。

本研究以我国云南、江苏、山东、广西、重庆等地参主产区[15]的10批样品作为研究对象，采用苯酚-硫酸法测定总糖和可溶性多糖含量，3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法测定其还原糖的含量并进行比较研究，分析其含量分布规律，旨在为地参的综合开发提供基础数据，为药材的道地性、栽培引种以及多指标质量评价体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地参自采或委托采集于全国5个主产区，详见表1，重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为唇形科地笋属植物毛叶地笋(L.lucidusvar.hirtus)的干燥根茎。D-无水葡萄糖对照品(批号：Must-3122601，纯度≥98%以上)，成都曼思特生物科技有限公司；苯酚(色谱纯)，山东西亚化学股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸、盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、碘、碘化钾等其他化学试剂均为分析纯，天津光复试剂有限公司。

表1 地参产地信息

1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器责任有限公司)；GL2202-1SCN电子天平(精度0.01 g)、SQP Sartorius电子天平(精度0.000 1 g)(德国Sartorius公司)；KH-2000DB型超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)；DZKW-S-6型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；Sigma4-16S型高速离心机(德国Sigma公司)；试验用水为娃哈哈纯净水。

1.3 方法

1.3.1 地参样品的预处理

预处理方法参照湖南省中药材标准[3]，将地参洗净泥沙，晾干水分，置于恒温干燥箱45℃烘干至恒重，将其粉碎过35目筛，备用。

1.3.2 显色试剂的配制

5%苯酚溶液：精密称取5.00 g重蒸苯酚，用纯净水溶解并定容至100 mL，摇匀，转至棕色瓶中置4℃冰箱中避光保存，备用。

DNS试剂：(1)称取2.50 g 3,5-二硝基水杨酸，用纯净水溶解并定容至250 mL，得1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。(2)称取1.725 0 g重蒸苯酚溶于10%氢氧化钠溶液中，并稀释至17 mL，加入1.725 0 g亚硫酸氢钠，溶解即得甲液。称取63.75 g酒石酸钾钠溶于75 mL 10%氢氧化钠溶液中，加入1% 3,5-二硝基水杨酸溶液220 mL混匀即得乙液。(3)将甲液与乙液混合摇匀即得DNS试剂，贮存于棕色试剂瓶中室温下放置7 d后使用。

1.3.3 对照品溶液的配制

精密称取减压干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品0.171 1 g于100 mL棕色容量瓶中，用纯净水溶解并定容至刻度，得浓度为1.171 mg/mL的对照品储备液。

1.3.4 供试品溶液的制备

1.3.4.1 总糖供试品溶液 总糖提取参照文献[16]，称取地参粉末0.5 g(精确至0.000 1 g)于50 mL离心管中，加入25 mL 10%盐酸溶液，沸水浴加热至水解完全。取1滴水解液于白瓷板上，加入1滴碘-碘化钾试剂，水解液不显蓝色则为水解完全。取出放冷，4 000 r/min离心5 min，转移上清液于50 mL容量瓶中，加入20 mL纯净水复提残渣，合并上清液并定容至刻度，摇匀。精密移取1.00 mL于50 mL容量瓶中，用纯净水定容至刻度，摇匀，即得。

1.3.4.2 可溶性多糖的供试品溶液 取一定量的地参粉末，加入适量石油醚(60～90℃)，在60℃水浴中回流1.5 h进行脱脂，挥干溶剂。称取0.5 g(精确至0.000 1 g)脱脂样品于50 mL离心管中，加入80℃蒸馏水20 mL，超声提取60 min后取出，放至室温，4 000 r/min离心5 min，取上清液于另一离心管中，残渣中加水10 mL，重复提取合并上清液。加入Sevage试剂(正丁醇∶三氯甲烷=1∶5，V/V)10 mL，涡旋振荡，离心，取上清液，加入5倍量的无水乙醇，摇匀，于4℃条件下静置24 h，弃去上层液，用无水乙醇洗涤沉淀2次，水浴挥干乙醇，用水将沉淀溶解转移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀后精密移取1.00 mL于25 mL容量瓶中，用纯净水定容至刻度，摇匀，即得。

1.3.4.3 还原糖的供试品溶液 称取地参粉末0.5 g(精确至0.000 1 g)于离心管中，加水15 mL，45℃水浴提取60 min，取出放冷，过滤至25 mL容量瓶中，加入8 mL水复提残渣，合并上清液并定容至刻度，摇匀，即得。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 总糖和可溶性多糖标准曲线

分别移取0.50、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00 mL葡萄糖储备液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度摇匀，制得标准系列工作液。分别取1.00 mL于10 mL比色管中，以1.00 mL纯净水作空白对照，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，再迅速加入5.0 mL浓硫酸，立即盖盖，混匀[13]。置80℃水浴中加热15 min，取出迅速用流水冲洗冷却。以空白管校零，于490 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y=0.0101X+0.024 2，相关系数r=0.999 3，在11.71～234.20 μg/mL浓度范围内线性良好。

2.1.2 还原糖标准曲线

分别吸取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL葡萄糖储备液于25 mL比色管中，加水至2.00 mL，以2.00 mL纯净水作空白，加入1.5 mL DNS试剂，摇匀，置于沸水浴中加热8 min，取出迅速用流水冲洗冷却，用纯净水定容至25 mL，摇匀。以空白管校零，于520 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y=0.014 0X-0.033 3，相关系数r=0.999 0，在4.68～46.84 μg/mL浓度范围内线性良好。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

精密吸取1.00 mL总糖、可溶性多糖和还原糖供试品溶液(S1)各6份，分别按照“2.1.1”和“2.1.2”项下进行显色测定其吸光度，计算RSD值分别为0.06%、0.32%和0.25%，表明精密度良好，符合分析要求。

2.2.2 重复性试验

取地参粉末(S1)按“1.3.4”项下对应的方法制备供试品溶液，每个组分平行6份，再分别按照“2.1”项下对应的方法测定吸光度，得总糖、可溶性多糖和还原糖的RSD值分别为0.82%、2.33%和1.40%，表明该方法的重复性良好。

2.2.3 稳定性试验

精密吸取1.00 mL总糖、可溶性多糖和还原糖供试品溶液(S1)各1份，分别按照“2.1.1”和“2.1.2”项下方法操作，每隔10 min测定吸光度，连续6次，计算RSD值分别为1.63%、2.66%和0.85%，小于3.00%，表明供试品溶液显色后至少在60 min内稳定性良好。

2.2.4 加样回收率试验

精密称取已测得总糖和还原糖含量的地参粉末(S1)0.25 g(精确至0.000 1 g)，取可溶性多糖溶液0.5 mL，各6份，分别加入葡萄糖储备液适量，按“1.3.4”项下对应的方法制备供试品溶液，以“2.1.1”和“2.1.2”项下进行显色测定吸光度并计算回收率和RSD值。结果显示总糖、可溶性多糖和还原糖的平均回收率为94.25%～105.10%，RSD值为0.30%～2.12%，符合分析方法要求。

2.3 样品测定

精密称取不同产地共10个地参样品各0.5 g(精确至0.000 1 g)，每个组分平行3份，分别按“1.3.4”项下对应的方法制备供试品溶液，以“2.1.1”和“2.1.2”项下进行显色测定吸光度，计算总糖、可溶性多糖和还原糖的含量，结果以±s表示，详见表2。结果表明，10批地参样品中，总糖含量介于39.62%～51.20%之间，平均含量为46.14%，比许泳吉[7]对野生地参中总糖的研究结果略高，表明地参在栽培过程中予以施肥和人工管理后品质更优。从地理位置来看，云南大理、腾冲、昆明以及广西玉林样品总糖含量相对较高。这是因为西南地区日照充足，降雨丰沛，地参生长过程中有足够的光合作用来合成糖类物质，因此总糖含量丰富。可溶性多糖含量为15.80%～21.98%，平均含量为18.10%；还原糖含量为1.27%～3.83%，平均含量2.54%。3种糖在不同产区样品间存在一定差异，其中以可溶性多糖和还原糖的差别较大，从可溶性多糖来看，产自江苏沛县(S9)样品中可溶性多糖含量最高，是平均值的1.21倍，产自重庆万州(S1)的地参含量较低，低于平均含量的13%，可溶性多糖作为地参品质评价的重要指标，药理作用的重要角色，在我国地域上呈现出了北方>南方>西南方的趋势，再次验证了黄小兰等[17]前期对地参中多糖的单糖组成的研究结果；同时，在还原糖方面，以重庆万州(S1)产区的含量最高，是平均含量的1.51倍，云南大理(S2)的含量最低，低于平均含量的50%。整体上看，还原性糖与总糖含量呈反比趋势，总糖含量高的产地，还原性糖含量偏低，总糖含量低的产地，还原性糖含量偏低，这可能与还原性糖的还原性质有关[18]，具体原因有待于进一步探究。

从不同产区地参中总糖、可溶性多糖和还原糖的组成结构上看，重庆万州的结构比(成分之间含量的比)为11∶4∶1，广西玉林(S5)22∶13∶1，山东菏泽为18∶7∶1，云南产区的3个样本(S2、S3、S4)平均结构比为38∶13∶1，江苏产区的4个不同样本(S7、S8、S9、S10)平均结构比为15∶7∶1。从不同地参的结构比上发现，地理纬度相近的云南、广西产区和江苏、山东产区在3种糖的结构比例上相似度极高，而在我国南方和北方却表现出较大差异。由此表明糖分的积累跟地理位置、环境条件等因素有关。

表2 不同产地地参中总糖、可溶性多糖和还原糖的测定结果(n=3)

2.4 聚类分析

以总糖、可溶性多糖和还原糖的含量作为变量，采用SPSS 20.0软件对不同产区的10批地参样品进行统计分析，当欧式距离为15时，10批地参被分为3类。其中S2、S3、S4、S5聚为第Ⅰ类；S1、S6、S7、S10聚为第Ⅱ类；S8、S9聚为第Ⅲ类，结果见图1。聚类分析将云南以及邻近的广西产区聚为一类，这与它们相近的含量和相似的结构比密切相关；同时江苏盐城(S8)和江苏沛县(S9)因其较高的可溶性多糖和还原糖含量被聚为一类，品质最佳；另一方面北方的山东菏泽(S6)、江苏徐州(S7)、江苏宿迁(S10)与西南方的重庆万州(S1)存在交叉，没有完全区分开，因为这几个产区在我国地理位置上同属北纬30°～35°范围内，日照量接近。从整体上看，5个大产区10个小产地根据纬度不同被分成了南北2类，与含量结果测定相符，表明生态因子对地参中糖类成分的积累存在一定影响。

图1 不同产地地参样品聚类结果Fig. 1 Clusteranalysis of L. lucidus var. hirtus from different habitats

3 讨论

本研究测定还原糖时采用了3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法，由于此法在不同样品检测中波长存在差异，既要考虑是否有最大吸收，同时要兼顾该波长下结果的稳定性[19]，故本试验分别以DNS试剂作为空白对葡萄糖对照品显色液、供试品显色液以及以纯水作为空白，对DNS试剂和供试品显色液在400～800 nm范围内进行光谱扫描，在兼顾最大吸收和排除干扰的情况下，确定最佳波长为520 nm。通过方法学考察，该法具有操作简单、专属性强、灵敏度高、回收率及精密度良好等优点。

还原糖是指具有还原性的糖类，一般是含醛基或酮基的单糖、含醛基的二糖，不仅在有机体的代谢中起着重要作用[20]，其含量的高低更关系到地参后期加工[21]。总糖是水溶性糖和水不溶性多糖的总和，包括还原糖、测定条件下能水解为还原性单糖的二糖和低聚糖，以及可能部分水解的淀粉。可溶性多糖是地参的主要活性成分，具有抗氧化、降血糖血脂、抗肿瘤以及改善免疫系统的作用。因此，地参中糖类物质的含量是其品质评价的重要指标。

本试验对不同产地地参中总糖、可溶性多糖和还原糖的含量进行测定，旨在分析出内在规律。结果发现，糖类物质在不同产地间存在差异，以总糖来看，南方的云南和广西产区含量较高，平均值为50.17%；以可溶性多糖来看，北方的5个样品平均含量最高，为18.70%；从还原糖方面看，北方高出南方2倍左右，与西南地区的重庆万州相差无几；从3种糖类物质的内在结构比上看，纬度为22°～26°的南方产区结构比更为接近，能很好的聚为一类，纬度为31°～35°的北方、西南方产区一致性较好，这可能与不同纬度条件下日照的长短有关。这一检测结果，不仅为地参产品的综合开发提供了新的思路，而且为其栽培引种指明了方向，还为其结合三萜类、酚酸类等其他成分指标进行多指标质量评价提供科学依据。