邸建永 张美姿 刘 烨 刘 丽 徐凤琴

天津市第一中心医院 生殖医学科（天津 300192）

生殖异常包括自然流产、胚胎停育、死胎、死产、生育畸形儿或智力低下儿等[1]，引起生殖异常的因素很多，其中遗传因素占很大比重。有研究发现，在不育夫妇中男性染色体异常率显著高于女性[2]，另外，Y 染色体长臂上的无精子因子（azoospermia facter，AZF）对精子的生成起着重要的作用，AZF 缺失也会引起男性生殖异常。我们回顾分析2013年12月到2019年2月到天津市第一中心医院生殖医学科就诊的2230 对生育异常夫妇中男性核型分析结果和其中432 例少精子症或无精子症患者的Y 染色体微缺失的结果，探讨男性异常核型和AZF 缺失与生殖异常的关系。

对象和方法

一、研究对象

2013年12月到2019年2月到天津市第一中心医院生殖医学科就诊的2230 对夫妇中的男方，平均年龄（31.5±4.9）（20～63）岁，纳入标准：少精子症、无精子症或夫妇曾经有过生育异常史（自然流产、胚胎停育、死胎、死产、生育畸形儿或智力低下儿），且女方染色体正常。

二、方法

（一）精液常规分析

采用手工操作进行检测，按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册（第5 版）》的精液分析标准进行，精子浓度低于15×106/mL 的患者诊断为少精子症，常规镜检无精子，对精液离心，镜检沉渣，连续3次均未发现精子者诊断为无精子症。

（二）染色体检查

经患者知情同意后，用5mL 注射器抽取静脉血2mL 经肝素抗凝，30 滴接种于6mL 的培养基，37℃培养72 小时，常规染色体标本制备，G 显带。计数20 个分裂相，分析5 个细胞核型。异常核型则加倍计数分析。根据《人类细胞遗传学国际命名体制》描述染色体异常核型。

（三）Y 染色体微缺失检测

用上海透景提供的Y 染色体微缺失检测试剂盒，采用两管多重PCR 扩增，四个通道（FAM/VIC/ROX/Cy5）荧光检测的方法，检测AZF 三个区域六个序列标签位点 （Sequence Tag Site） 包 括AZFa 区：SY84，SY86；AZFb 区：SY127，SY134；AZFc 区：SY254，SY255。设置两个内对照基因： 男性性别决定基因（Sex-determining region of the Y chromosome，SRY）和编码锌指蛋白基因ZFX/ZFY（Zinc finger protein,X-linked,ZFX；Zinc finger protein, Y-linked, ZFY），设置阳性对照 （正常男性DNA）和阴性对照（超纯水）。

检测时，首先抽提血液标本DNA，然后以抽提标本为模板进行多重PCR 扩增，当存在靶标序列时，引物退火，并在Taq DNA 聚合酶作用下进行延伸，Taq 酶水解荧光探针，使得荧光探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，游离的报告基团数目与对应PCR 扩增产物正相关。分析系统可以自动监测荧光信号，判断。

结 果

2230 例男性核型分析结果异常核型75 例，异常检出率3.36%（75/2230），其中结构异常包括相互易位19例，罗氏易位11 例，倒位19 例，占异常的65.33%(49/75)，性染色体异常26 例，占异常的34.67%（26/75）。

432 例少精子症或无精子症男性检测出32 例Y 染色体存在AZF 区域的缺失，检出率7.41%（32/432），其中AZFc 区域缺失20 例占比最高为62.5%（20/32），AZFb+c区域缺失7 例占比为21.88%（7/32），AZFa 区域缺失1 例，AZFb 区域缺失2 例，分别占比3.13%（1/32） 和6.25%（2/32），AZFa+b+c 区域缺失2 例占比6.25%（2/32），这2例患者核型均为46，XX，其中1 例SRY 缺失。

讨 论

一、异常核型对生育异常的影响

染色体异常是引起生殖异常的主要原因，导致反复流产、死胎、死产、生育畸形儿[3,4]。Ravel C 在10202 名供精生育力正常的男性中检出异常核型率仅为0.37%[5]，而本研究中生育异常的男性异常核型检出率为3.36%，高于正常人群。

本研究中结构异常共35 例，全部为常染色体异常，包括罗氏易位、相互易位、倒位。罗氏易位和相互易位也称平衡易位，平衡易位男性携带者可以表现为从正常到少精甚至无精子的多种临床表现[6]，对于少精子或无精子的相互易位携带者可能是断裂点涉及到精子生成的基因，断点的出现使相关的基因在精子发生的过程中表达改变，导致精子发生障碍[7]。本研究中核型为46,XY,t(1;8)(p22;p21) 的男性表现为无精子症，R.X.Wang 研究发现1 号染色体的p22 断点与男性不育有显著的相关性，多名携带者表现为无精子和严重少精子[8]。本研究中出现罗氏易位11 例，常见的为45,XY,rob (13;14)(q10;q10)和45,XY,rob(14;21)(q10;q10)，罗 氏 易 位 引 起 的 少精子症或无精子症，有研究认为是由于减数分裂时检验点的干预，两次检验点的干预导致无精子症，第一次检验点干预导致少精子症[9,10]。本研究出现了1 例同源染色体易位46,XY,rob（21;21），该携带者在精子生成的过程中，会出现易位型的21 号染色体不分离，受精形成的胚胎会形成三体或单体，生育正常核型的后代的几率很低。本研究出现14 例仅inv(9)核型和2 例易位并inv(9)核型，临床表现为不孕，自然流产和胎停育等。有研究者以行辅助生殖技术夫妇为研究对象，发现inv（9）的携带者行辅助生殖技术的结果与对照组无统计学显著差异，女性携带者组和男性携带者组有统计学上相似的结果，但女性携带者的预后可能比男性携带者好[11]。但也有文献报道认为inv（9）与生殖异常相关[12]。

表1 异常核型及临床表现

表2 Y 染色体AZF 缺失及临床表现

本研究中性染色体异常核型包括47,XXY、47,XYY、45,X/46,XY、46,XX 等。核 型47,XXY 又 称 为Klinefelter 综合征，男性中发病率2/1000，是导致男性不育最常见的一种类型，本研究中18 例47，XXY，1 例47,XXY/46,XY，发生率0.85%(19/2230)。Klinefelter 综合征至少会多出一条X 染色体，减数分裂或有丝分裂时，性染色体不分离均可导致患者性染色体的异常。两种核型形式存在，90%为47,XXY,10%为47,XXY/46,XY，或多出更多X 染色体，典型Klinefelter 综合征症状包括：（1） 男子乳房发育和睾酮缺乏引起的性欲低下；（2）小睾丸和支持细胞功能障碍引起的不育；（3）专注力和学习能力的降低[13]。Klinefelter 患者从青春期开始逐渐失去精原干细胞，成年Klinefelter 综合征患者的睾丸内的曲细精管表现纤维化和透明化，绝大部分Klinefelter 患者表现为无精子症，但通过显微取精可以在40%的患者睾丸内发现精子，在通过ICSI 获得自己的后代[14]。核型为45,X/46,XY 的患者2 例，45,X/46,XY患者在新生儿的发病率1.5/10000，具体形成机制尚未明确，可能与细胞有丝分裂过程中Y 染色体不能顺利分离进入两个子代细胞相关。45,X/46,XY 嵌合体临床表现多样化，包括表现为女性表型、两性畸形和正常男性表型等[15]。表型为男性的患者绝大部分表现为无精子症而无生育能力，可能与高比率的AZF 基因缺失密切相关[16]，本研究中2 例患者表现无精子症，进行了Y 染色体微缺失的检测，没有AZF 位点的缺失，对于45,X/46,XY 嵌合体男性表现为无精子症的机制需要进一步研究。46,XX 核型患者2 例，为46,XX 男性性反转临床表现无精子症，阴毛呈女性分布，促性腺激素水平升高，睾酮水平低。PCR 检测结果（见表2），1 例存在SRY基因，1 例SRY 基因缺失。46,XX 男性性反转的发病机制还不十分明确，对于存在SRY 基因的，认为SRY 基因易位到X 染色体的短臂或常染色体上，对于不存在SRY 基因的有以下假设：（1）SRY 基因位于嵌合的性腺上；（2）46,XX 核型抑制其向男性发育的基因发生突变；（3）SRY 基因下游的性别决定基因发生改变[17]。

二、Y 染色体微缺失和生殖异常

AZF 区域位于Y 染色体的长臂上，这个区域包含精子发生相关的基因。Y 染色体AZF 区域缺失是仅次于Klinefelter 综合征导致男性不育的第二大已知遗传原因[18]，本研究中432 例无精子或少精子患者，共有32 例患者存在不同形式的缺失，检出率7.4%，在以往的研究报道中AZF 缺失在无精子症和少弱精子症患者中发生率为3.3%～11.75%[19,20]，AZF 分为AZFa、AZFb、AZFc 三个相互独立的区域[21]，对应5 种形式的缺失AZFa、AZFb、AZFc、AZFb+c、AZFa+b+c，不同形式缺失会导致不同的临床表现，且不同形式发生的频率不同，与以往研究一致[20]，本研究中AZFc 区域缺失发生的频率最高，占比为62.5%，AZFc 区域缺失患者的精液表现是多样化的，可以表现为正常、 少精子症或无精子症[22]，本研究中20 例AZFc，其中10 个无精子症，8 个重度少精子症，2 个少精子症。AZFa 缺失在AZF 区域缺失出现频率较低，本研究中仅出现1 例，占比3.13%，AZFa 缺失表现出唯支持细胞综合征和无精子症[22]，AZFb 或AZFb+c 缺失可表现出唯支持细胞综合征和生精阻滞[23]，本研究中两种缺失比例分别6.25%和21.88%，均表现为无精子症。5 种形式的AZF 区域缺失类型中，AZFc 缺失的男性可以自然受孕拥有自己的后代，但后代有可能是不育的[24]，AZFc 区缺失的严重少精子或无精子症患者，可以通过睾丸显微取精手术和人工辅助生殖技术获得自己的后代，助孕时建议行性别选择，以避免遗传缺陷的垂直传播。

综上所述，男性染色体异常因素对夫妇生殖异常影响不容忽视，检测男性染色体，对于查找生育异常的病因，指导生育和阻止有害遗传因素传递给下一代有积极的意义。