许 永，蔡为荣，闻志莹，祝 晗

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

荷花(Nelumbo Nucifera)是药食同源植物，其性温和，味微苦，可以活血止血、祛湿消风寒、清热凉血、美容、解暑等，且能治疗疱疮、湿疹、跌打损伤、出血等症。荷花原产于中国，至今已有3000多年，资源丰富。目前，已有学者[1-3]研究了荷花中黄酮类、荷花碱、挥发性油等一些活性物质，但相关文献较少，鲜有见到这些活性物质的开发和利用，关于荷花的产品也仅仅只有荷花酒、荷花茶[4]等，其营养价值并没有得到充分利用。

花青素是一种重要的天然水溶性黄酮类色素，广泛分布于各种植物中，使得不同植物的根、茎、叶、花、果实和种子等具有不同的紫色和蓝色[5]。花色苷具有独特的生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤和抗炎活性[6]等，这种化合物在许多研究中都引起了人们的广泛关注[7-8]。然而，尽管它们在自然界中具有多样性和广泛分布性，但在市场上能买到的花色苷数量有限，而且价格昂贵。据文献[9]报道，荷花中含有多种花色苷，但是目前，还没有文献对荷花中花色苷的制备进行研究。

一般来说，花青素的制备生产需要3个主要步骤，即提取、纯化和分离。大孔吸附树脂作为一种低成本、易获得的分离材料，已被广泛应用于多种植物花色苷的纯化。然而，只使用大孔树脂纯化，不能制备出高纯度的花色苷，还需要继续结合其他的分离纯化方法。而高速逆流色谱(HSCCC)作为一种新兴的分离技术，具有操作简便、制备量大、无不可逆吸附等特点，被广泛用于花色苷色素类的分离。

研究拟利用AB-8大孔树脂、聚酰胺柱层析、高速逆流色谱等技术手段对荷花色苷进行分离和纯化，旨在AB-8大孔树脂和聚酰胺纯化的基础上，再利用高速逆流色谱技术进一步探讨荷花花色苷分离纯化工艺，以期对花色苷进行有效分离，提高其纯度，并通过液相色谱-质谱联用法(LC-MS)对花色苷鉴定。这不仅能为扩大荷花花色苷应用范围提供技术参考，同时也有助于今后进一步对荷花花色苷单体进行分离研究。

物流企业按照不同的作业划分为：运输中心、仓储中心、包装中心、配送中心及物流信息中心。现以包装作业中心发生的人力费用为例，包装作业中耗费的资源包括人力费用、折旧费、维修费、水电费、物料费等。对水费来说资源动因是水的吨位数，包装中心的成本动因是人工工时。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

(3)花色苷的质量浓度和纯度的测定。采用pH示差法，参考Denev P[10]等的方法略作改动。称取质量m(mg)花色苷粉末用蒸馏水溶解，定容到体积V(mL)，然后取1 mL用pH为1.0的氯化钾缓冲液稀释至10 mL，另取1 mL用pH为4.5的乙酸钠缓冲液稀释至10 mL，分别在520 nm下和700 nm下测吸光值。花色苷质量浓度c(g/L)和纯度α按式(1)、式(2)计算。

1.2 试验设备

HH-6恒温水浴锅(国华电器有限公司)；RE-85Z旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)；SHB循环真空泵(郑州市上街华科仪器厂)；UVmini-1280紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；DHL电脑数显恒流泵、冷冻干燥机(美国SIM公司)；高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)；Agilent 1100高效液相色谱、Agilent 1290高效液相色谱-G6545四级杆飞行时间质谱联用仪(美国Agilent公司)。

1.3 方法

所渭摘录词句的习惯就是说在读书过程中，随时记录自己喜欢的名言警句以及优美词句、精彩片段;所谓圈圈点点的习惯是指小学生在读书的过程中，积极思考，用笔在书上圈画批注，圈记读书过程中的生字生词，记下自己读某段时的观点和想法;所谓写读后感的习惯是指读一篇文章或一本书以后，把自己心中的感悟写出来。这一点很重要，读后感写多了写作素材的积累也就越来越多，自己写文章时就可以信手拈来。只要学生在读书后心有感悟，写成片段或者整篇都行，学生在写读书体会时必然经过思考，细心揣摩自己的感悟与作者要表达的感情，这样边想边写，不但增长了知识，而且积累了深厚的语言功底，从而能够提高写作能力。

式中，A=(ApH 1-ApH 4.5)520 nm-(ApH 1-ApH 4.5)700 nm；484.82是矢车菊-3-葡萄糖苷氯化物的相对分子量；24 825是矢车菊-3-葡萄糖苷氯化物在pH为1.0的缓冲液中520 nm下的摩尔吸光系数；V是花色苷溶液体积；DF为稀释倍数。

材料：干荷花(山东济宁)。试剂：聚酰胺(100～200目)；AB-8大孔树脂；无水乙醇(AR)；盐酸(AR)；氯化钾(AR)；冰醋酸(AR)；醋酸钠(AR)；甲醇(AR)；乙酸乙酯(AR)；甲基叔丁基醚(AR)；正丁醇(AR)；乙腈(HPLC)；TFA(HPLC)；甲酸(HPLC)。所有试剂皆购买于国药集团化学试剂有限公司。

(1)

(2)

(2)荷花花色苷的提取。将荷花花瓣于35 ℃烘干，然后粉碎，过80目筛。称取荷花粉末，按照料液比1∶25加入pH为2的60%乙醇溶液(盐酸调节)，常温下避光搅拌浸提60 min。然后抽滤，滤渣再次浸提，合并两次滤液，真空浓缩。将浓缩液加入4倍体积的无水乙醇，静置12 h，进行醇沉，除去浓缩液中的多糖成分。

2.2.2 FPG 绘制ROC曲线，FPG对2型糖尿病进行诊断的最佳切点为6.44 mmol/L，特异度为86.3%，灵敏度为89.0%；在43例FPG＜6.44 mmol/L患者中，IGT7例，NGT18例，IFG5例，IFG+IGT5例，DM7例；而在 FPG≥4.44 mmol/L61例患者中，IFG、IGT与NGT均为0例，IFG+IGT6例，DM56例。

(4)乙酸乙酯萃取。醇沉结束，滤去沉淀的多糖，滤液低温浓缩除掉乙醇，将浓缩液倒入萃取瓶中，加3倍体积的乙酸乙酯，震荡充分，避光静置4 h，萃取完毕后保留水相，以除去浓缩液中的脂溶性成分。对乙酸乙酯相全波长扫描，考察萃取次数对萃取效果的影响。

(5)AB-8大孔树脂纯化花色苷。参照李颖畅[11]等，选择AB-8大孔树脂纯化荷花花色苷(规格2.6 cm×60 cm)。将预处理过的大孔树脂湿法装住，上样时考察了花色苷样品溶液pH(1、2、3、4、5)、质量浓度(0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL)、上样流速(0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min)对大孔树脂吸附的影响，并测定了泄漏曲线；洗脱时考察了洗脱液pH(1、2、3、4、5)、流速(0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min)、乙醇体积分数(10%、20%、30%、60%)对洗脱效果的影响。通过测定洗脱液的吸光度来计算花色苷的吸附解析率，绘制吸附解吸曲线，确定最佳工艺参数，获得纯化后的花色苷样品1，测定纯度。吸附率E和解析率D按式(3)、式(4)计算。

随着新课程改革的不断推进，初中体育教学的现状相较于以往有了很大的改善，教学水平有了显著提高，学生的身体素质和心理素质有了显著增强。但是从目前初中体育教学的开展现状来看，在教学实践中仍旧存在一定的问题，而学生主动参与性较低便是其中之一。学生作为体育教学的主体，一旦主动参与性不足，则会直接对教学质量造成影响，也就导致无法实现既定的教学目标。因此，必须要采取有效手段加以解决。

(3)

(4)

式中，c0为花色苷样液质量浓度；c1为上样完毕流出液质量浓度；c2为花色苷洗脱液质量浓度；V0为花色苷样液体积；V2为花色苷洗脱液体积。

(6)HSCCC分离荷花花色苷。将大孔树脂柱纯化后的样品1用聚酰胺柱进行纯化，50%甲醇-水(0.1%乙酸)反相洗脱，除去鞣质和低极性杂质，浓缩冻干得纯化后样品2，测定纯度。参考刘雪辉[12]方法以水∶甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈(6∶1∶3∶1)含0.1%TFA配置溶剂体系，于分液漏斗中静置1 h分层，固定相为上相，流动相为下相，超声脱气25 min。将上相以30 mL/min泵入管路，直至泵满。再以2 mL/min的流速泵入下相，温度25 ℃，转速850 r/min，检测波长280 nm。待整个体系平衡时，称取100 mg花色苷样品2于10 mL流动相溶解，进行上样。根据色谱图的出峰情况，收集每个组分，以获得高纯度的花色苷。

更重要的是，有时我们的耳朵告诉我们“这是极弱音”，但这只是我们的错觉。实际上，在多数作品中，“极弱”的往往并非旋律声部，而是旋律以下的伴奏声部。如果演奏者无法把伴奏声部（通常有较多音符）控制在极弱的层面，那就必须在旋律声部上多加力量，那么整首作品就显得过于粗暴。另外，旋律与伴奏声部都弹成“极弱”也是常见谬误。而控制伴奏声部的极弱则要求我们将重心保持在肘关节，并将肘关节相应抬高，此时，我们即可自如地通过紧贴琴键的指尖第一关节，以极其微小的动作控制声音。

液相条件:采用C18柱(4.6 mm×150 mm)，粒径为3.5 μm，流速为0.6 mL/min，柱温为30 ℃。溶剂集体采用二元流动相。流动相A：含有0.5%甲酸的水溶液，流动相B:含有0.1%甲酸的乙腈溶液。采用现行洗脱模式，0～5 min，10%B；5～10 min，10%～20%B；10～14 min，20%～30%B；14～16 min，30%～60%B；18 min，60%～10%B；18～20 min，10%B。检测波长为520 nm。

质谱条件:使用的质量检测器是安捷伦飞行时间(TOF)质量分析仪，配备安捷伦喷射流电喷雾电离源。在以下条件下，干燥气体温度300 ℃，流量6.0 L/min；喷雾器压力35 psi；护套气体温度350 ℃，流量11.0 L/min；毛细管电压3 500 V；喷嘴电压1 000 V；碎片器电压175 V；撇渣器电压65 V；扫描范围从m/z100到m/z1 500。

2 结果与分析

2.1 乙酸乙酯萃取结果分析

花色苷萃取乙酸乙酯相紫外扫描图如图1所示。由图1可以看出，乙酸乙酯相紫外光区280 nm和340 nm附近有吸收峰，而在可见光区520 nm附近没有吸收峰，说明乙酸乙酯对除去黄酮类化合物有较好的效果，并且不会造成花色苷的损失。随着萃取次数的增加，吸收峰越来越小，第1次萃取乙酸乙酯相最大吸收峰为1.906 A，第3次只有0.113 A，表明乙酸乙酯所能萃取出来的黄酮越来越少，第3次虽还含有少量黄酮，但吸收峰值接近于0，再增加萃取次数效果不明显，选择萃取3次。

图1 花色苷萃取乙酸乙酯相紫外扫描图

2.2 AB-8大孔树脂动态吸附试验

根据商务部公布的数据，中国煤炭使用补偿费为5元/吨，二氧化硫完全治理费为485元/吨，以这些数据为基础进行计算，计算公式如下：

由图2b可知，大孔树脂对花色苷的吸附率会随着样液质量浓度的增加而减小，在上样质量浓度为0.5 g/L时，吸附率最高，为89.9%；上样质量浓度为5 g/L时，吸附率最低，为67.2%。这可能是因为树脂吸附过程是一个动态平衡的过程，平衡需要一定的时间。如果流速固定，大孔树脂与样品接触的时间就固定，增大了上样质量浓度，所需要的平衡时间就会增加。固定了接触时间，样品质量浓度增大，使得树脂没有吸附平衡，导致吸附率下降。图2B中样液质量浓度为0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL时，吸附率分别为89.9%、88.6%、87.3%，差别不大，但是2 mg/mL上样质量浓度会缩短大量的上样时间，所以选择样液质量浓度为2 mg/mL。

由图2c可知，大孔树脂对花色苷的吸附率随着上样流速的增加而呈下降的趋势，流速在0.5 mL/min时吸附率最高，为90.7%，在3 mL/min时吸附率最低，为77.9%。可能是由于固定上样质量浓度，增大了上样流速，缩短了接触时间，导致吸附率下降。流速为1 mL/min时吸附率为88.9%，与0.5 mL/min时的吸附率差别较小，为节约上样时间，选择1 mL/min。

AB-8大孔树脂纯化花色苷动态吸附试验结果如图2所示。从图2a中可以看出，AB-8大孔树脂对花色苷的吸附能力随着样液pH的增加，先增大后减小，在pH为2时吸附率最高，pH为5时吸附率最低。这可能因为当pH为1时，花色苷主要存在形式为黄烊正离子结构，离子化合物不易被大孔树脂吸附，当pH>2且继续增大时，花色苷上的羟基电离氢质子容易与碱结合，导致花色苷与树脂间的吸附能力减弱，使得吸附率下降[11]。所以上样pH选择2。

图2 AB-8大孔树脂纯化花色苷动态吸附试验

AB-8大孔树脂纯化花色苷泄漏曲线的测定如图3所示。由图3可以看出，在收集管数为33管时，为上样泄漏点，即上样终点。随着上样体积的增加，大孔树脂吸附的花色苷越来越多，逐渐达到饱和，再继续增加上样体积，由于树脂的饱和，花色苷不再被吸附，而随着样液流出来。当流出液吸光度为样液吸光度的10%时为泄漏点的判定点即上样终点。按分部收集器每管收集10 mL，即上样体积为330 mL。

定义7 称ftr/tr-1(A(tr)/A(tr-1))，(2≤r≤m)为马尔可夫过程{ξ(t)，t∈T}，(t1 <…

(7)LC-MS检测鉴定。

图3 AB-8大孔树脂纯化花色苷泄漏曲线的测定

2.3 大孔树脂动态解析试验

洗脱液流速和pH对花色苷洗脱效果的影响如图4所示。由图4a可知，随着乙醇洗脱液流速的增大，花色苷流出液的峰高越来越低，并且峰型变宽，而且洗脱花色苷所需要的洗脱液也相对增加。流速为0.5 mL/min时峰最高，吸光度为1.12 A，完全洗脱所需体积为360 mL；流速为3 mL/min时峰最低，吸光度为0.621 A，完全洗脱所需体积为700 mL，洗脱液的用量约为流速是0.5 mL/min时的一倍。这不仅会造成乙醇浪费，而且还加重了后续花色苷洗脱液的浓缩任务。图4a中，流速为1 mL/min时，峰吸光度为1.04 A，完全洗脱所需洗脱液体积为400 mL，与0.5 mL/min差别较小，从时间考虑，1 mL/min节约了近一半的时间，所以选择洗脱液流速为1 mL/min。

由图4b可知，花色苷解析率随着pH的增大而减小，在pH为1时，解析率最高为88.9%，pH为5时，解析率最小，为66.2%。图4b中pH为2时的解析率为87.7%，与pH为1时的解析率差别较小。但在pH为1时，酸性较大，花色苷在此条件下，可能会使相连的糖基易水解，造成花色苷结构的不稳定[13]，所以选择洗脱液pH为2。

图4 洗脱液流速和pH对花色苷洗脱效果的影响

为了去除花色苷提取物中的杂质，并保证花色苷被洗脱下来，选择了10%、20%、30%、60% 4个梯度的乙醇进行洗脱。不同体积分数洗脱液紫外扫描图如图5所示。从图5可以看出，10%和20%的乙醇洗脱液在280 nm和520 nm下有吸收峰值，分别为A280nm=0.771、A520nm=0.437和A280nm=0.863、A520nm=0.452；并且在520 nm下的吸收峰高于30%和60%的乙醇洗脱液。而30%和60%的洗脱液在520 nm处有吸收峰，而在280 nm下却无吸收峰，说明在这两个洗脱液中花色苷含量非常低，甚至可能没有花色苷。这是因为花色苷类物质不仅在可见光区520 nm附近有吸收峰，而且在紫外280 nm附近也有较大的吸收峰，所以通过测定色素的紫外-可见光谱，就可以判断是否含有花色苷类物质[14]。不同体积分数洗脱液对荷花花色苷洗脱效果的影响如表1所示。由表1可知，10%和20%洗脱液中花色苷纯度分别为23.5%和24.1%，远远高于30%和60%洗脱液的2.11%和0.82%，30%和60%洗脱部分杂质较多。且在洗脱液乙醇体积分数为20%时，解析率可以达到85.2%，与30%和60%的解析率相差较小，所以选择20%乙醇体积分数洗脱。既节约了乙醇，又方便后续对花色苷的分离实验。

将花色苷提取物通过AB-8大孔树脂在最佳工艺下纯化，荷花花色苷纯度由4.32%提升到了23.7%，纯度提高了近5.5倍，说明AB-8大孔树脂对花色苷的纯化效果较好。

表1 不同体积分数洗脱液对荷花花色苷洗脱效果的影响

2.4 HSCCC分离荷花花色苷

HSCCC分离荷花花色苷如图6所示。采用1.3(6)的方法，以水∶正丁醇∶甲基叔丁基醚∶乙腈(6∶3∶1∶1，V/V)含0.1%甲酸作为溶剂体系，通过HSCCC分离，得到4个组分。对收集的4个组分单独进行紫外鉴定，发现组分2和组分4在520 nm附近无特征吸收峰，而组分1和组分3在280 nm和520 nm处都有吸收峰，故推测组分2和组分4为非花色苷类物质，组分1和组分3为花色苷类物质。在该条件下，上样量100 mg干粉，一次性制得组分1干粉16.44 mg，纯度为76.1%，组分3干粉29.16 mg，纯度为83.3%，花色苷回收率为91.1%。

峰会上，中国汽车维修行业协会常务副秘书长王逢铃为峰会致辞。上海钜轩汽车用品有限公司董事长王海霞以“逆向盈利新商业模式”为主题进行培训式演讲。演讲内容涵盖了“什么是汽车服务终端商业模式”、“盈利模式如何打造”、“赋能终端该如何去做”以及“什么是逆向盈利”等。峰会现场气氛活跃，与会嘉宾们热情高涨、收获颇丰。

图5 不同体积分数洗脱液紫外扫描图 图6 HSCCC分离荷花花色苷

2.5 LC-MS检测

HSCCC分离荷花花色苷组分液相检测图如图7所示。由图7可以看出,组分1中含有1种花色苷为色素Ⅲ，出峰时间为10.10 min；组分3中含有两种花色苷为色素Ⅰ和色素Ⅱ，出峰时间分别为4.96 min和6.77 min。荷花花色苷鉴定结果如表2所示。由表2可知，色素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在520 nm下都有最大吸收峰。且A440nm/Amax百分比分别为29%、31%和27%，接近30%；A310nm/Amax百分比分别为7.5%、9.4%和11%，都小于20%；表明了3种色素糖苷的位置，都为花色素-3-O-糖苷，并且都未发生酰基化[13]。花色苷质谱分析图如图8所示。由图7a和图8a可知，色素Ⅰ保留时间为4.96 min，MS信息表明，其分子离子峰[M+]为597.1，在质谱中检测到碎片离子为m/z 303.1；m/z 303.1是飞燕草色素的特征离子，碎片([M-294]+)对应于花色苷分子中失去一个桑布糖基所得的碎片。该研究结果与Du[15]研究飞燕草素-3-O-桑布双糖苷的质谱信息相一致。因此，推测色素Ⅰ为飞燕草素-3-O-桑布双糖苷。由图7a和图8b可知，色素Ⅱ保留时间为6.77 min，MS信息表明，其分子离子峰[M+]为581.1，碎片离子为m/z 287.1。m/z 287.1是矢车菊色素的特征离子，碎片([M-294]+)对应于脱去一分子桑布糖基后所得的碎片，该研究结果与Du[15]和Zhao[16]的研究中矢车菊-3-桑布双糖苷的质谱信息相一致，因此推测色素Ⅱ为矢车菊素-3-O-桑布双糖苷。从图7b和图8c可以看出，色素Ⅲ的保留时间为10.10 min，MS信息表明，其分子离子峰[M+]为493.1，在质谱中检测到的碎片离子为m/z 331.1。m/z 331.1为锦葵色素的特征离子，碎片([M-162]+)对应脱去一分子葡萄糖所得到的碎片，该研究结果与Deng[9]的研究中锦葵色素-3-O-葡萄糖苷的质谱信息一致，故推测色素Ⅲ为锦葵色素-3-O-葡萄糖苷。

图7 HSCCC分离荷花花色苷组分液相检测图

图8 花色苷质谱分析图

表2 荷花花色苷鉴定结果

3 结论

实验发现用乙酸乙酯萃取，能较好地去除荷花花色苷浸提液中的非花色苷黄酮类物质；在优化后的最佳AB-8大孔树脂纯化条件下纯化荷花花色苷，可以使花色苷的纯度达到23.7%，纯化效果较好；通过HSCCC技术分离花色苷，能够获得两种较高纯度的花色苷组分1和组分3，纯度分别为76.1%和83.3%，经LC-MS对两种花色苷组分鉴定，发现花色苷组分1含有一种花色苷，推测为锦葵色素-3-O-葡萄糖苷，组分3含有两种花色苷，推测为飞燕草素-3-O-桑布双糖苷和矢车菊素-3-O-桑布双糖苷。该方法操作简便，重现性好，适于大量制备荷花高纯度花色苷，为花色苷进一步药理研究及质量控制提供物质基础。