张清华，李莎，廉政，刘永飞，杨建德，刘燕霏,通信作者，张大伟,通信作者

利用DNA重组技术生产L-苯丙氨酸的研究

张清华1，李莎2，廉政1，刘永飞2，杨建德1，刘燕霏1,通信作者，张大伟2,通信作者

（1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 中国科学院 天津工业生物技术研究所，天津 300380）

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-Phe）是人体八大必须氨基酸之一，在人类的新陈代谢中起着重要的作用。而现在生产L-Phe的技术还远远满足不了市场的需求，本研究目的是利用DNA重组技术以及微生物发酵的方法提高L-Phe产量。研究方法包括利用易错PCR技术对基因进行点突变建立一个基因库，通过突变作用于的正常转录从而调控工程菌株产生L-Phe的量；利用质粒作为载体转化到感受态细胞中，并从中筛选出高产菌株；通过质粒的构建、筛选、验证、发酵等一系列试验，结果表明工程菌株构建成功，为L-Phe规模化生产提供科学依据。

L-苯丙氨酸；DNA重组；筛选；发酵

L-苯丙氨酸（L-Phe）属于芳香族氨基酸，在常温下为白色固体，比旋光度是-35.1°。分子量是165.19，分子式是C9H11NO2。随着科学的进步与发展，至今L-Phe已经可以大规模量产，其应用于医药、食品、化工等领域，主要作为其他产品的中间品，如L-Phe是抗癌药苯丙氨苄的中间体；在化工领域，其主要作为护肤品的生产原料，L-Phe有延迟白发形成的功效；但现在L-Phe大多用来作为阿斯巴甜的生产原料，每年大概总产量的60%均用于生产阿斯巴甜[1-3]。阿斯巴甜又称蛋白糖，因为其代谢快，不易在体内聚集，而且又比蔗糖甜（200倍），所以阿斯巴甜是糖尿病患者和肥胖人群的重要食品。2005年以前，国外主要是美国、日本和欧洲一部分国家有着较发达的生产技术，其生产量大约占每年世界生产量的2/3左右，国内也有一些厂家生产，主要集中在北京、天津、上海、济南等地区，但大多数都自产自用，很难对外销售。近些年，随着国内部分公司与荷兰、美国等大公司的合作，目前我国的L-Phe生产已经得到了飞速发展[4-7]。本试验利用易错PCR技术对（重组蛋白A，recombinant porin A protein）基因进行点突变建立一个基因库，是一段长990 bp能够影响产生L-Phe的基因，通过控制酶和诱导剂的量来控制突变个数，构建筛选出新的高产菌株，对L-Phe的生产工艺甚至是代谢工程研究提供重要科学依据。

1 材料

易错PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、纯化试剂盒、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、抗生素、葡萄糖、氨水、消泡剂、琥珀酸、茚三酮、甘-亮氨酸二肽、甘油、DH5感受态细胞，DNA聚合酶以及大肠杆菌质粒均为实验室保存。

2 方法

2.1 易错PCR

利用PCR技术对片段进行易错PCR[1]，通过Mn+作为诱导剂使其基因产生随机点突变，建立一个基因库，然后再在此基因库中筛选出高产的菌株，因要利用酶切连接的方式将与相连，选择的是和酶切位点。利用设计好的引物进行PCR，引物序列见表1，采用30 μL体系，PCR时可将前变性设为94 ℃ 3 min，然后按照94 ℃变性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，做30个扩增循环即可。

表1 引物序列

引物名称引物序列 rpoA-KpnI-LFctcggtaccatgcagggttctgtgacagag rpoA-BamHI-LRtagggatccttactcgtcagcgatgcttgc

将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。将PCR产物全部缓慢加入加样孔中，加完样品后加入10 μL的1 kb DNA marker用来进行比对。电泳结束后用Gel Extrction Kit（200）试剂盒对片段进行回收。

将与片段同时进行双酶切。酶切时选择50 μL体系，准备两个PCR管，分别加入片段和质粒15 μL，10×buffer 5 μL，1 μL BamHI酶，1 μL KpnI酶，剩余用超纯水补齐。加完后将PCR管插入水漂，放入37 ℃水浴锅中进行酶切，大约2～3 h，以便切出黏性末端进行连接。酶切过后要用cycle-pure Kit（200）试剂盒对切好的片段进行纯化。得到所需的基因片段溶液。

2.2 重组质粒构建

连接时采用10 μL体系，按照载体：片段（摩尔比）＝3∶1进行连接，向PCR管中加入2 μL，6 μL，再加入1 μL DNA buffer，1 μL DNA连接酶，混合均匀后放置常温下链接2～3 h。

将连接好的质粒转入DH5感受态中，以得到需要的质粒。首先从-80 ℃冰箱中取出DH5感受态并使其融化，将连接的10 μL体系加入到DH5感受态中，然后将其冰浴30 min，之后放入42 ℃水浴锅中热激1 min，再置于冰上2 min，向EP管中加入1 mL LB液体培养基，放入37 ℃摇床300 r/min震荡培养1 h，取出后5 000 r/min离心 3 min进行浓缩，弃去1mL上清液，将剩下的菌液混匀，然后都涂于LB氨苄抗性固体培养基上， 37 ℃过夜培养。

将培养好的细菌进行PCR验证，验证时选择片段与两端大约300 bp的片段作为验证序列。用20 μL体系进行PCR，加入2 μL挑取单菌落稀释后的菌液，PCR时前变性设为95 ℃ 5 min，然后按照94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，做30个扩增循环。

2.3 工程菌株高产菌的筛选

将构建好的质粒用电转化的方式转入xlzp（自命名，实验室保存酪氨酸缺陷型）的工程菌感受态中。将电脉冲杯超净台吹干后-20℃预冷，从 -80 ℃取出感受态细胞置于冰上融化，电脉冲条件选择1 800 V。将混有质粒的感受态细胞移入电脉冲杯中，吸水纸擦干外面的水珠，将电脉冲杯放入，电转后立即取出并加入温预的1 mL LB液体培养基，混匀后移入EP管中，37 ℃摇床300 r/min培养1 h，然后取适量菌液涂于AMP抗性的LB固体培养基上过夜培养。

向培养好的细菌平板上加1 mL LB液体培养基，将平板上所有细菌混匀，然后取出500 μL，用流式细胞仪进行筛选。根据提前设定好的程序，便可根据荧光值测得产量高低，从而筛选出比较高产的菌株。

2.4 初步发酵筛选

将流式筛选出来的细菌再进行涂板，37 ℃过夜培养，然后挑取较大的单菌落进行两批次96孔板发酵试验。将60 mL LB与15 μL AMP混合后，每孔加入500 μL，然后挑取单菌落接种在每个孔内。将平板盖盖好后放入恒温恒湿摇床中800 r/min震荡培养12 h。然后按照1∶50的比例将发酵好的菌液接种到种子培养基中，方法同上。发酵7 h后再由种子培养基接种到发酵培养基中，并加入500×盐离子1 mL[2]。

发酵48 h后进行产量验证。取发酵液50 μL稀释10倍测量600，取50 μL稀释100倍，离心后测荧光值。验证前先取琥珀酸30 μL、甘-亮氨酸二肽30 μL和茚三酮80 μL混合均匀后加入到待测样品中[3]，并置于60 ℃温箱中2 h，待其冷却至室温后加入30 μL碱性铜离子试剂，并在12 min内放入酶标仪，完成读数[4]。

将菌株平板划线，37 ℃过夜培养。然后挑选平板上的单菌落接入LB液体培养基中过夜培养，溶氧电极过夜极化，同时发酵罐空罐灭菌，配制发酵用的80%葡萄糖以及无机盐离子和抗生素，以及需要补料用的酪氨酸。之后按照1∶50的比例将过夜活化的菌株接入种子培养基中培养7 h，同时标定pH电极。发酵培养基加入到发酵罐中整体再灭菌一次，灭菌只留一个排气口，其他口全部封死，以免污染培养基。灭菌的同时可测定补糖的流速，然后组装补料葡萄糖瓶、25%氨水瓶和消泡剂瓶等，组装完毕后准备发酵，先开冷凝水，发酵罐降到37 ℃并设置10 ℃ 10 min，排气后调回38 ℃。将控制检测系统与发酵罐接好后，设置各参数，1 h后溶氧电极标至100%，温度调为33 ℃。

按1∶10将种子液加入发酵罐中，并加入抗生素（1 000×AMP），开始发酵。条件37 ℃，pH 7.0，（溶氧）30%。待降至30%后耦联，搅拌速率300～990 r/min，通风比2～3 vvm，补糖过程中残糖控制0～5 g/L之间，预计发酵时间60 h。发酵过程中每2 h取样一次，用以监测残糖和600，酪氨酸不足时及时补充酪氨酸。取1 mL样品离心后将上清液留存，用来最后测量产量。每8 h可镜检一次，确定是否有杂菌污染。密切观察发酵罐情况，泡沫过多时应及时消泡，避免喷灌[5-6]。

3 结果与分析

3.1 基因片段的扩增及质粒的构建

经凝胶电泳得到目的片段约为990 bp，见图1。根据电泳凝胶结果判定片段扩增成功，对此片段进行回收处理并测定其核酸浓度为83.6 ng/μL。

重新连接的片段经电泳后，出现大约1300 bp大小的目的条带，说明连接阳性。将验证正确的细菌稀释液接入20 mL AMPLB液体培养基中，置于37 ℃摇床过夜培养。用Plasmid mini Kit I（200）试剂盒提取质粒，得到构建好的质粒。

图1 rpoA基因电泳凝胶结果

注：1为1 kB DNA marker；2为基因

3.2 初步发酵试验

通过两批次96孔板发酵试验得出结果：A1、A2、A3、A4为L-Phe标品，第一批次通过对比菌株发酵的600生长情况（表2）与产量（表3）进行综合分析，B1、B2、B3、G6、F7、A12、D12、H12、E12荧光较高且生长良好。第二批次同样进行菌株发酵的600生长情况（表4）与产量（表5）的对比，B1、B2、F2、A4、E4、A6、G6、B2、C10、A12、G12荧光较高且生长良好。经过两批发酵数据与标品综合分析确定G6菌株很有潜力，可进行下一步发酵罐发酵验证试验。

表2 第一批96孔平板发酵试验菌株OD600生长情况

123456789101112 A0.4010.5940.7290.9990.4870.470.4760.4370.4350.4840.4580.454 B0.5820.5120.5480.5050.4820.5090.4960.3660.5040.4770.4710.473 C0.5270.5450.550.490.570.5060.560.4210.5620.4850.4910.495 D0.5610.520.5350.520.5080.5090.5140.4920.5870.4590.5760.468 E0.5150.4930.5060.5040.5430.6060.5220.4440.5240.4970.5090.478 F0.5190.5170.5270.5080.4990.4870.8170.4950.5040.4380.5540.962 G0.5460.5230.4890.50.7270.4930.4940.4850.5440.4680.510.49 H0.4950.5930.4860.8790.5170.9420.5250.520.5170.5050.4740.526

表3 第一批96孔平板发酵试验各菌株产量情况

123456789101112 A19.04221.90524.50926.9121.70821.64622.02620.77118.89718.32721.41124.894 B25.72525.2324.93624.1820.89120.14719.57420.41619.55116.30820.23521.982 C22.01517.50920.91321.50116.70420.54918.43718.33518.75219.56223.09220.107 D20.83719.68316.95921.2121.70720.24218.73720.76720.65521.13119.48425.592 E19.38219.65921.09918.88320.15420.12820.2919.84920.08518.04218.30423.923 F24.48318.35918.87819.31921.68819.24324.81817.19123.34720.97917.90422.422 G20.22419.76420.63818.30821.66133.48819.47221.66919.90918.56719.18120.438 H22.49619.40518.822.11219.69921.6220.55220.80820.82122.00419.63326.583

表4 第二批96孔平板发酵试验菌株OD600生长情况

123456789101112 A0.4780.6080.8690.9590.9410.8380.6430.4410.4970.5050.6550.56 B0.4590.4530.4480.430.4480.4260.5530.4840.4730.4880.4770.467 C0.4850.460.4860.4250.4790.5240.4770.4290.4470.4310.6150.515 D0.5540.4730.4960.4650.4820.5070.4540.460.4460.6350.4540.417 E0.4690.5160.5080.5480.3840.4560.4930.4990.4490.4810.4530.425 F0.490.4720.480.4810.4610.4530.4660.8910.4430.4630.4540.424 G0.510.4490.5330.720.7590.5550.8810.4270.4740.4550.4890.485 H0.7120.5580.8630.6610.8970.9440.990.7410.4850.4370.4530.537

表5 第二批96孔平板发酵试验各菌株产量情况

123456789101112 A16.85318.98620.30427.45423.6625.19721.92722.8723.60623.80821.28120.061 B24.84326.84221.38421.09920.44723.41724.37625.70125.14819.06123.74425.642 C21.23418.82318.83422.318.94121.35624.82721.02616.86626.18922.32619.751 D20.43619.54323.37422.62424.03923.88722.81818.92822.61922.25422.23822.388 E19.51517.69820.66124.69914.21920.40420.99825.27921.91322.77219.7919.738 F23.52824.35222.28214.70921.94218.75219.29221.18521.34220.88217.93319.701 G19.04219.78221.9719.85122.53129.53718.25220.03419.30721.79323.13425.124 H16.29721.03622.65120.99222.34121.53319.83123.84722.23620.38523.94722.799

从结果中找到的G6菌株进行发酵试验（7 L发酵罐）。上罐之前需要对菌株进行三级活化，即LB培养、种子培养基培养、发酵培养基培养。

经发酵数据分析，从发酵开始到第26 h发酵菌株处于自身生长期，并没有L-苯丙氨酸产生，并且在第24 h溶氧达到40 mg/L时，开始与通气量耦联，此时温度调为38 ℃，从第28 h开始的取样中测得有L-苯丙氨酸的产量，最终经过66 h的发酵试验，L-苯丙氨酸的最终产量为41.75 g/L，见图2，与现有工程菌株34.68 g/L的产量相比有明显提升。

图2 发酵时间与产量变化曲线

4 讨论

Mn+或者DNTP的浓度不平衡都可以使碱基发生错配，达到基因片段产生错误碱基的目的。在PCR过程中每一个循环都有错配的可能，所以一个PCR做下来（一般30～40个循环）将会产生很多不同的基因序列，这就达到了建立基因库的目的，此方法显然比定点突变或敲除更加简单高效，比紫外诱变对菌株的伤害更小[7]。而且利用紫外线等物理因素对其辐射产生的突变，具有不可控性，在最后所得到的菌株中虽然生存能力加强，但是有可能其L-Phe产量却降低了。本次试验利用高通量筛选方法，直接用两批96孔板发酵对比，从中选出相对高产量和高600的菌株进行最后的发酵罐试验，所以要比摇瓶发酵筛选更省时省力[8]。现代技术用微生物发酵法生产L-Phe的最高产量是89 g/L，但其前提是以谷氨酸作为原料，原料代价昂贵。现在L-Phe的最高产量是1990年Backman 等[9]公布的50 g/L。然而，几乎所有L-Phe高产菌株的详细遗传信息目前尚未公开。但微生物发酵生产L-Phe的方法依然是目前最简单高效的[10]。有研究表明，确实可以提高对L-Phe的产量，只是还未确定是哪个编码碱基对其产生的影响，当对特定基因组进行随机点突变时，便可利用其随机性，从基因库中找到所需要的突变位点[11-13]。本次试验围绕基因展开，主要运用了PCR技术、基因重组技术、高通量筛选技术、微生物发酵技术等，并得到最终工程菌株，这为规模化生产L-Phe提供了参考依据。

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Study on production of L-phenylalanine by DNA recombination technology

ZHANG Qing-hua1, LI Sha2, LIAN Zheng1, LIU Yong-fei2, YANG Jian-de1, LIU Yan-fei1, Corresponding Author, ZHANG Da-wei2,Corresponding Author

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300380, China）

L-phenylalanine is one of the eight essential amino acids and plays an important role in human metabolism. Now the production of L-Phe technology cannot satisfy the demand of the market. Therefore, the goal of this study is to improve the yield of L-phe by using reombinant DNA technology and the method of microorganism fermentation. In the process of the study, a gene pool was established by using error-prone PCR to carry out point mutation ofgene. The amount of L-phe produced by the engineered strain was regulated by the mutation acting on the normal transcription of. Plasmidwas used as a vector to transfer into competent cells, and high-yield strains were screened from it. The plasmid was constructed, screened, validated, and verified and a series of tests were used to state the feasibility of this method in this process. The experimental results showed that the engineered strain was successfully constructed and this study provides scientific basis for L-Phe large-scale production.

L-Phenylalanine; DNA recombination; screening; fermentation

1008-5394（2020）02-0038-06

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.009

Q815

A

2019-05-29

天津市自然科学基金项目（16JCYBJC23500）

张清华（1993-），男，本科在读，研究方向：微生物发酵。E-mail：569069380@qq.com。

刘燕霏（1970-），女，副教授，硕士，研究方向：预防兽医学。E-mail：674383583@qq.com。

张大伟（1978-），男，研究员，博士，研究方向：微生物发酵。E-mail：zhang _dw@tib.cas.cn。

责任编辑：张爱婷