石慧 莫晨阳 金喆昊

[摘要]本研究从学院食堂附近的土样、人工湖水样和鲫鱼、鲶鱼的肠道中分离得到6株产蛋白酶菌株。经摇瓶发酵复筛后，选择产酶活高的菌株2、菌株5和菌株6进行形态学观察、生理生化鉴定和部分酶学性质研究。结果表明菌株2可能为短短芽孢杆菌，菌株5可能为苏云金芽孢杆菌，菌株6可能为地衣芽孢杆菌。研究3株菌所产蛋白酶的最适pH，发现2号、5号和6号菌株的最适pH分别为6.0、8.0和10.0。菌株5和菌株6所产蛋白酶在pH为8.0～10.0的缓冲液中处理30min后活性几乎不变，在碱性环境中均具有较好的稳定性。菌株5和菌株6所产蛋白酶的最适反应温度均为30℃，低于30℃处理30min活性几乎不变;50℃处理30min后，菌株5和菌株6的残余酶活分别20%和40%。

[关键词]低温碱性蛋白酶;芽孢杆菌;筛选;鉴定;酶学性质

中图分类号：Q78;Q55 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202001

低温碱性蛋白酶通常指在pH为碱性条件下，0℃～30℃内催化效率较高，对热相对不稳定的一类蛋白酶[1]。低温碱性蛋白酶主要由嗜低温菌和耐低温菌产生[2]，包括假单胞杆菌属、芽孢杆菌属和黄杆菌属等[3]。多数微生物的碱性蛋白酶还具有水解酯键、酰胺键、转酯和转肽的能力，因此被用于植物蛋白加工行业，特别是用于大豆蛋白的降解，增加其营养效价[4-5]。目前，食品、水产饲料、洗涤剂行业和化妆品行业所用的蛋白酶主要是中温碱性蛋白酶，其最适作用温度通常为50℃～70℃。而这些产品的使用温度在发展中国家通常在40℃以下，低温碱性蛋白酶在这些产品中替代中温碱性蛋白酶具有巨大的优越性[6-8]，具有广阔的应用前景。本研究筛选的几株低温碱性蛋白酶芽孢杆菌均具有较强的酶活，具有一定研究价值。

1 材料与方法

1.1 材料

样品来源：武汉设计工程学院食堂后土样、武汉设计工程学院人工湖水样、鲫鱼肠道、鲶鱼肠道。

初筛培养基：干酪素4.0g，KH2PO4 0.36g，Na2HPO4·7H2O 1.07g， NaCl 0.16g，CaCl2·2H2O 0.002g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.002g，胰蛋白胨0.05g，琼脂20g，蒸馏水1 000mL，调节pH至7.0～7.2。

发酵培养基：蛋白胨0.5%，干酪素0.8%，酵母膏0.1%，葡萄糖0.1%，氯化钠0.58%，柠檬酸三钠0.45%，琼脂2%，pH为8.0。

1.2 方法

1.2.1 產蛋白酶细菌的初筛

称样品10g稀释至10-5，取0.1mL 10-5稀释液涂布在初筛培养基平板上，30℃恒温培养36h后，观察长出的菌落周围酪蛋白水解圈产生的情况，挑取酪蛋白水解圈较大的菌落，划线分离纯培养并保存。

1.2.2 产蛋白酶细菌初酶液的制备

将筛选的细菌以5%的接种量接种于发酵培养基中，180r/min，28℃摇瓶培养36h，8 000r/min离心20min，取上清液，用细菌过滤器过滤除去残余的菌体，获得各菌株发酵液的无菌上清液即为粗酶液。

1.2.3 碱性蛋白酶活力的测定

碱性蛋白酶活的测定方法参考陈琳[7]的《产低温蛋白酶菌株Halomonassp.SD-02的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究》，酶活力单位定义参照《酶制剂工业》[9]。

1.2.4 产碱性蛋白酶细菌的复筛

用1.2.2中方法制备粗酶液，1.2.3法测定各菌株粗酶液的碱性蛋白酶活力，粗酶液和酪蛋白均用0.1 M Na2CO3/NaHCO3（pH=10.0）缓冲液稀释或溶解。选择碱性蛋白酶活力相对高的菌株为供试菌株。

1.2.5 产碱性蛋白酶细菌的鉴定

1.2.5.1 产碱性蛋白酶细菌的形态鉴定

10×100放大倍数下观察用碱性复红染色的菌株的形态、大小、芽孢的着生位置等并拍照;观察菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态并拍照。

1.2.5.2 产碱性蛋白酶细菌的生理生化鉴定

各菌株的生理生化鉴定项目见表2。

1.2.6 菌株所产碱性蛋白酶的最适作用pH的测定

将1.2.3中酶促反应的pH分别用柠檬酸盐/磷酸、磷酸缓冲液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液调节为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，测定各菌株的粗酶液在不同酶促反应pH中的蛋白酶活力。

1.2.7 各菌株所产的碱性蛋白酶对pH的稳定性测定

将各菌株的粗酶液分别用乙酸/乙酸钠缓冲液调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液调节pH至9.0、10.0、11.0、12.0处理30min，用福林酚试剂法测定各粗酶液的碱性蛋白酶活力。

1.2.8 菌株所产碱性蛋白酶的最适作用温度的测定

将1.2.3中酶促反应的水浴温度分别设定为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，测定各菌株的粗酶液在不同酶促反应温度中的碱性蛋白酶活力。

1.2.9 菌株所产碱性蛋白酶的热稳定性测定

将各菌株的粗酶液分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 、70℃水浴30min，用福林酚试剂法测定其碱性蛋白酶活。

2 结果与分析

2.1 产碱性蛋白酶细菌的筛选结果与分析

2.1.1 产蛋白酶细菌的初筛结果与分析

产蛋白酶细菌在初筛平板上28℃恒温培养36h后，不同菌落产生酪蛋白水解圈大小不同，选取水解圈大的菌落共计6株，见图1。

2.1.2 产碱性蛋白酶细菌的复筛结果与分析

测定6株产蛋白酶细菌的（pH=10.0）碱性蛋白酶活，结果见表1。

由表1可知，菌株2、菌株5和菌株6粗酶液的碱性蛋白酶活力相对较高，鉴定这3个菌株。

2.2 产碱性蛋白酶细菌的鉴定结果

2.2.1 产碱性蛋白酶细菌的形态鉴定结果

镜检菌株2、菌株5和菌株6的个体形态特征图片及这3株细菌的划线分离纯培养单菌落图片见图2。

结果显示，这33株菌株个体形态及菌落形态都有明显的差异，为不同的菌种。

它们镜检都能看到芽孢。菌株2菌落呈黄色，透明，湿润，边缘规则;菌株5菌体在显微镜下常成链状排列，菌落呈乳白色，不透明，湿润;菌株6芽孢与菌株5类似，菌体更短小，细胞间排列无规则，菌落前期湿润透明，后期干燥、多褶皱，中间和边缘凹陷。

2.2.2 产碱性蛋白酶细菌的生理生化鉴定结果与分析

菌株2、菌株5和菌株6生理生化指标鉴定结果见表2。

结合这3个菌株的形态及生理生化鉴定的试验结果，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常用细菌系统鉴定手册》，推测菌株2可能为类短芽孢杆菌属中的短短芽孢杆菌，菌株5可能为芽孢杆菌属苏云金芽孢杆菌，菌株6可能为芽孢杆菌属地衣芽孢杆菌。

2.3 菌株所产的碱性蛋白酶的部分性质测定结果

2.3.1 菌株所产蛋白酶的最适作用pH 结果与分析

见图3可知，当只改变蛋白酶酶活测定pH时，菌株2所产蛋白酶的最适作用pH为6.0，其所产蛋白酶在pH 7.0～10.0酶活大幅下降，pH为11.0时，酶完全失活;菌株5所产蛋白酶的最适作用pH为8.0，pH 9.0～10.0酶活小幅下降，pH为11.0时，酶完全失活;菌株6所产蛋白酶的最适作用pH为10.0，pH为11.0时，酶活开始急剧下降。鉴于菌株2实际产酸性蛋白酶，只是在碱性pH范围蛋白酶有一定的耐受性，在之后的研究中剔除菌株2。

2.3.2 各菌株所产碱性蛋白酶的最适作用温度结果与分析

由图4可知，菌株5的蛋白酶的最适作用温度为30℃，在25℃～35℃蛋白酶活力小幅下降，在50℃完全失活;菌株6的蛋白酶的最适作用温度为30℃，在35℃～50℃蛋白酶活力小幅下降。

2.3.3 菌株所产碱性蛋白酶对pH的稳定性测定结果与分析

菌株5产蛋白酶在pH 7.0～9.0较稳定，酶活力波动不大，接近最高酶活，在pH 3.0～4.0及pH 11.0时，酶完全失活;菌株6所产蛋白酶pH8.0～10.0较稳定，酶活力波动不大，pH接近10.0时酶活最高，在pH 3.0～4.0时，酶完全失活;pH为11.0时，酶活急剧下降（见图5）。

2.3.4 各菌株所产碱性蛋白酶的热稳定性测定结果与分析

菌株5和菌株6所产蛋白酶在20℃～30℃均较稳定，20℃～30℃处理30min酶活几乎不变。当温度超过30℃，随着温度的升高，酶活逐步降低。50℃保温30min后，菌株5的酶活降低到20%左右，菌株6的酶活降低到40%左右，可见两株菌所产蛋白酶的热稳定性均较差，菌株6略好于菌株5（见图6）。

3 结 论

本实验筛選出3株产蛋白酶的芽孢杆菌，菌株2为短短芽孢杆菌，菌株5为苏云金芽孢杆菌，菌株6为地衣芽孢杆菌。其中菌株2所产蛋白酶的最适作用pH为6.0，为酸性蛋白酶产生菌。菌株5所产蛋白酶的最适作用pH为8.0;菌株6所产蛋白酶的最适作用pH为10.0，均为碱性蛋白酶产生菌株。

菌株5所产蛋白酶的最适作用温度为30℃，在25℃～35℃蛋白酶活力小幅下降，在50℃完全失活;菌株6的蛋白酶的最适作用温度为30℃，在35℃～50℃蛋白酶活力小幅下降。

参考文献

[1] 杨胜远，陆兆新.微生物低温碱性蛋白酶的研究进展[J].食品与发酵工业，2004，30（4）：93-97.

[2] 林念炜，张锐，赵晶，等.南极产低温蛋白酶菌株Marinobactersp. R2的发酵条件及酶学性质研究[J].厦门大学学报（自然科学版），2004，43（6）：866-869.

[3] 吕明生，王淑军，李华钟，等.海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchraHH407产低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究[J].食品科学，2010，31（21）：298-303.

[4] 马永强，尹永智，杨春华，等.地衣芽孢杆菌2709产碱性蛋白酶的发酵动力学研究[J].食品工业科技，2010，31（6）：159-161.

[5] 张浩，张帅，张娜，等.地衣芽孢杆菌2709产碱性蛋白酶的分离纯化及性质[J].食品工业科技，2010，26（2）：129-133.

[6] 陈静，王淑军，黄炜，等.产低温碱性蛋白酶海洋适冷菌SY的筛选[J].微生物学杂志，2005，25（4）：38-42.

[7] 陈琳.产低温蛋白酶菌株Halomonassp.SD-02的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究[D].长春：东北师范大学，2007.

[8] 路福平.热稳定低温碱性蛋白酶的定向改造[J].科技计划成果， 2011（21）：22-23.

[9] 张树政.酶制剂工业[M].北京：科学出版社，1984.