黄伟钊，吴颖猛，胡荣贵，叶红雨，傅剑华

1中山大学肿瘤防治中心·华南肿瘤学国家重点实验室广东食管癌研究所，广州510089；2 中山市人民医院

基金项目：广东省自然科学基金资助项目(2016A030310409)。

第一作者简介：黄伟钊(1978-)，男，副主任医师，博士，主要研究方向为食管癌的综合治疗。E-mail： zhijiaoyy@163.com

通信作者简介：傅剑华(1965-)，男，主任医师，博士，主要研究方向为食管癌的综合治疗。E-mail： jiahu0101@126.com

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，是世界上第八大最常见癌症和第六大最常见的癌症死亡原因[1]。食管癌主要分为两型：食管鳞状细胞癌(ESCC)与食管腺癌(EAC)，我国主要以前者为主。微小RNA(miRNA)是长度为20～22个核苷酸的非编码RNA亚型，与多种肿瘤的发生发展有关，如非小细胞肺癌[2]。通常情况下，miRNA可与靶基因的3′-UTR结合，从而促进癌细胞的增殖、迁移[3]。如miR-216a可通过抑制TLR48来抑制肾癌细胞的生长。miR-1269家族包括miR-1269a和miR-1269b两个成员，miR-1269a是在大肠癌中首次被发现的一种癌基因miRNA，其基因位于染色体4q13.2。miR-1269a可通过与转化生长因子-β12(TGF-β12)间的反馈环促进癌症的发展和转移[4]。在肝癌中，miR-1269a可靶向调节LRP6和SPATS2L13的表达来影响其发展[5]。SOX6属于性别决定区Y框相关转录因子D亚家族的一员,染色体位置为11号染色体短臂15.2～15.3区域，具有多种生物学功能，如促进软骨形成、神经发育及骨髓造血等[6]。SOX6基因编码的蛋白可通过高迁移率族蛋白与DNA结合，在细胞分化、增殖及凋亡中发挥关键作用[7]。在食管癌的相关研究中发现，SOX6基因是miR-1269a的靶基因，miR-1269a可抑制SOX6蛋白表达，促进肿瘤的发生发展。但两者在食管癌中的具体作用机制尚不清楚，有待进一步研究。2013年1月～2019年6月，我们检测了食管癌组织中miR-1269a和SOX6的表达，并探究二者在食管癌发生发展中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2019年6月于中山市人民医院住院治疗的食管癌患者120例，纳入标准：①经病理活检或术后病理检查明确诊断；②均为首次诊断食管癌，既往未接受过抗肿瘤治疗；③临床病理资料完整，且均签署知情同意书。排除标准：①患有其他消化系统疾病，如反流性食管炎、胃溃疡等；②患有其他系统疾病或恶性肿瘤，如胃癌、肺癌等；③患有免疫功能缺陷疾病。120例患者中，男109例、女11例，年龄30～70(55.3±3.7岁)，其中≥55岁者52例，<55岁者68例；组织病理检查结果显示，中低分化55例，高分化65例；肿瘤TNM分期(参照文献[8]标准)：Ⅰ期51例，Ⅱ期33例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例；有淋巴结转移52例；肿瘤浸润深度T1：42例，T2：29例，T3：28例，T4：21例。

1.2 食管癌及癌旁正常组织中miR-1269a和SOX6表达检测 收集术中获取的新鲜癌组织和癌旁正常组织(距离癌组织>5 mm)，保存在液氮中，立即转运至实验室，置于-80 ℃冰箱中保存。取50 mg标本，应用TRIzol法提取总RNA(试剂盒购自美国Invitrogen公司)，使用微量核酸蛋白检测仪检测RNA浓度，将符合标准的RNA冻存，备用。使用TaqMan miRNA反转录试剂盒(购自美国Invitrogen公司)将RNA反转录合成cDNA，反应条件：42 ℃ 60 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。U6作为内参基因。反应条件：65 ℃ 5 min ，16 ℃ 30 min，72 ℃ 15 min。实验步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行。miR-1269a正向引物：5′-CGTTGGAT-GAAGTCTCATGATAGGCCATC-3′，反向引物:5′-ATTGCGTGTCGT-GGAGTCGGCAATGC-3′；SOX6 正向引物：5′-GCTGGAGGAGATGACTC-GGAC-3′，反向引物:5′-GTTCGGTCCACTATTGATGGGG-3′；内参基因U6正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物:5′-GGCTGAGAACTGAATTCCA-3′；以GAPDH作为内参照，正向引物:5′-CGGATTTGGT-CGTATTGGG-3′，反向引物:5′-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。反应体系：cDNA 1.0 μL，正反向引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.125 μL，1 μL 20×SYBR Green及1 μL dNTPs，用去离子水补足体系至20 μL。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循环40 次，72 ℃延伸5 min。每个样本至少重复3次。用FastStart Essential DNA Green Master(美国罗氏制药国际集团公司)检测miR-1269a和SOX6的相对表达量，以2-ΔΔCt法计算miR-1269a和SOX6的相对表达量。

2 结果

2.1 食管癌组织与癌旁组织中miR-1269a、SOX6 mRNA表达比较 食管癌组织与癌旁正常组织中miR-1269a的相对表达量分别为1.243±0.213、0.816±0.098，癌组织中miR-1269a的相对表达量高于癌旁正常组织(t=19.950，P=0.000)；食管癌组织与癌旁正常组织中SOX6 mRNA相对表达量分别为0.761±0.082、1.027±0.162，癌组织中SOX6 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(t=16.048，P=0.000)。

2.2 食管癌组织中miR-1269a、SOX6表达与患者临床病理特征间的关系 食管癌组织中miR-1269a、SOX6表达与肿瘤TNM分期、组织分化程度及肿瘤浸润深度有关(P均<0.05)，与患者年龄、性别及淋巴结转移无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 食管癌组织中miR-1269a与SOX6表达的相关性 Pearson相关分析显示，食管癌组织中miR-1269a与SOX6表达呈负相关(r=-0.716，P=0.000)。

3 讨论

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。虽然近年来其发病率有所下降，但由于食管癌早期症状不明显，因此部分患者就诊时已进入晚期。食物过烫、经常进食刺激性食物是罹患食管癌的危险因素，还可能与环境因素和家族遗传史有关。食管癌的治疗方式包括手术、化疗、放疗或两者结合等方式，但癌症患者的治愈率低，预后差，食管癌患者的术后5年生存率为14%～22%[9]。

表1 食管癌组织中miR-1269a、SOX6表达与患者临床病理特征间的关系

miR-1269a是近年发现的与肿瘤转移相关的miRNAs，在多种肿瘤细胞中均呈高表达状态，如肝癌、胃癌。有文献报道，miR-1269a参与癌细胞的增殖、分化及转移，使得肿瘤恶性程度升高，进一步影响其治疗效果[5]，如miR-1269a可促进结肠癌及胆管癌细胞的增殖、分化及侵袭过程。miR-1269a通过调节靶基因(如MYCBP2、ZNF70、SPATS2L和LRP6)的表达，进而发挥其生物学功能[10，11]。因此，我们推测miR-1269a在食管癌的发生发展中亦发挥一定作用。本研究结果显示，食管癌组织中miR-1269a相对表达量高于癌旁正常组织。提示miR-1269a可能参与了食管癌的癌变进展，其机制可能为高表达的miR-1269a上调靶基因(如MYCBP2)表达，促进细胞增殖，并且加速了细胞从G0向G1期的转变过程，从而加快了癌细胞的增殖和分化，使得肿瘤细胞数量持续升高。本研究结果还显示，miR-1269a表达与肿瘤TNM分期、组织分化程度及肿瘤浸润深度有关。研究表明[4]，抑制miR-1269a表达可抑制细胞生长，降低细胞分化的速度。同时miR-1269a可上调Cyclin D1表达，抑制Rb的磷酸化，抑制肿瘤细胞的分化功能，使得肿瘤分化程度降低，TNM分期升高，肿瘤恶性程度进一步升高[12]。亦有研究发现，miR-1269a可上调TGF-β表达，而TGF-β诱导上皮间质转化，或通过PI3K诱导Akt激活肿瘤细胞的侵袭和浸润[13]。

SOX6是具有多种功能的转化因子，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，如SOX6可抑制上皮间质转化、抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭等[14]。SOX6在肾透明细胞癌、膀胱癌及骨肉瘤中均呈低表达状态，并与肿瘤的预后相关。有研究表明，SOX6在食管癌中呈低表达状态，其通过上调p53和p21同时下调Cyclin D1/CDK4、Cyclin A和β-catenin的表达，从而抑制食管癌的进展[15]。而SOX家族的其他成员，如SOX2、SOX4和SOX9，已在多种肿瘤疾病中被认定为肿瘤抑制因子[16]。本研究结果显示，食管癌组织中SOX6相对表达量低于癌旁正常组织，机制可能为SOX6是miR-1269a的靶基因，miR-1269a表达上调时导致SOX6表达下降[17]。本研究结果还显示，食管癌组织中SOX6的相对表达量与肿瘤TNM分期、组织分化程度和肿瘤浸润深度有关。其原因可能为SOX6通过抑制胰腺β细胞中的Cyclin D1或激活红细胞中SOCS3的转录来抑制肿瘤细胞的分化，使得肿瘤恶性程度增加，临床分期升高[18]，并且SOX6发挥其抑癌基因的作用[19]，抑制肿瘤细胞的增殖，停滞了肿瘤细胞的生长周期，因此，当食管癌中SOX6表达下调时，会使肿瘤细胞的分化程度降低，肿瘤细胞的浸润深度增加，进一步增加了肿瘤的恶性程度。

本研究结果还显示，SOX6与miR-1269a表达呈负相关。SOX6是miR-1269a下游的靶基因，miR-1269a是SOX6重要的调控者[20]，且miR-1269a抑制SOX6的表达。因此，在食管癌中二者存在相辅相成、相互制约的作用，在疾病的发生发展过程中共同发挥重要作用。

综上所述，食管癌组织中miR-1269a表达上调，SOX6表达下调，与肿瘤TNM分期、组织分化程度及肿瘤浸润深度有关；二者联合检测有助于食管癌病情判断。